外泌体在非小细胞肺癌早期诊疗中的研究进展

肺癌作为一种高度致死性的恶性肿瘤，占所有新增癌症病例的13.2%，占所有癌症相关死亡的25.9%，平均5年生存率18.1%。此外，大量临床数据也表明，早期肺癌患者术后五年生存率要明显高于晚期肺癌患者。外泌体是具有脂质双层膜结构、直径为30～100nm的微小囊泡，是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程后由细胞主动分泌的一种物质。虽然几乎机体内的所有类型细胞都能够分泌外泌体，如：网织红细胞、树突状细胞、内皮及上皮细胞等，但近些年来的研究显示，体内不同细胞分泌的外泌体，特别是肺癌细胞来源的外泌体，不仅可以调节自身细胞的增殖和迁移，还可以影响其他细胞的生理功能，进而调控肺癌的发生发展。Munson等发现，外泌体所携带的生物活性物质可能作为肿瘤诊断和预后的标志物。因此，本文就近年来外泌体在非小细胞肺癌（NSCLC）的发生发展、早期诊断、治疗及预后方面的研究进展进行综述。

1.外泌体概述

外泌体是在研究网织红细胞的成熟过程中被Johnstone等人发现并命名的。外泌体是一种球形的纳米级细胞外囊泡，直径30～100nm，密度1.13～1.19g/ml。在生理和病理条件下，外泌体都可以被一些细胞以胞吐的方式所释放，如：免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞，并且其广泛分布于各种体液中，如：尿液、唾液、血液、羊水、脑脊液及病理性腹水等，同时，由于其起源于相应的母细胞，故肿瘤细胞来源的外泌体有望成为一种全新的非倾入性检查替代以往的组织活检技术。

外泌体的组成较为复杂，其内含有多种生物大分子，如：核酸（双链DNA和各种RNA亚型）、蛋白质和脂质。这些分子被外泌体携带进入血液循环，而后被靶细胞吸收，从而调节靶细胞基因表达和细胞功能。此外，外泌体相关的miRNA作为短单链和非编码RNA分子，调节致癌基因或抑癌基因的表达，参与细胞分化、细胞凋亡及细胞信号的传导。有研究表明，外泌体能影响肿瘤微环境的形成、增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力、介导肿瘤免疫抑制及参与肿瘤放化疗抵抗进而促进肿瘤的发生发展。

2.外泌体在肺癌进程中的作用

肺癌细胞来源外泌体（LCC-exosome）可以通过刺激肿瘤血管的形成来促进肿瘤的生长。据相关报道称，LCC-exosome中的miR-210可以通过调节基质细胞中酪氨酸受体激酶A3的含量，促进肿瘤血管的生成；而LCC-exosome中的miR-23a则可以通过激活脯氨酰羟化酶及抑制紧密结合蛋白ZO-1来促进肺癌的生血管作用。此外，有研究发现，外泌体中的内容物可以触发上皮-间质转化（EMT）。晚期肺癌患者血清中外泌体波形蛋白表达增加，促使人正常支气管上皮细胞出现EMT，从而使肺支气管正常上皮细胞出现增殖，迁移能力。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞来源的外泌体能够诱导CD4+T分化为调节性T细胞，抑制机体的抗肿瘤免疫反应；肺癌细胞分泌的外泌体含有miR-21和miR-29a，可在免疫细胞中结合并激活TLR8，使TLR介导的NF-κB信号通路活化，从而导致肿瘤的生长和转移。在肺癌的侵袭和转移过程中，细胞间通讯扮演着重要的角色。据有关报道称，NSCLC分泌的外泌体内TGFβ和IL10的高表达与肺癌的转移密切相关。此外，激活的T细胞可以通过调控Fas信号通路增加基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，进而促进肺癌的转移。这些机制有望成为肺癌治疗的潜在靶点。虽然大多数外泌体都是促进肿瘤的侵袭与转移，但也有报道称，外泌体miR-302b可以通过抑制TGFβRⅡ来抑制肺癌细胞的转移与增殖。

3.外泌体在肺癌早期诊断中的作用

3.1外泌体相关miRNA与肺癌的诊断

miRNAs是一类含有20～25个核苷酸的非编码小RNA，能够通过下调或抑制靶mRNAs来调节转录水平上的基因表达，目前非编码RNA被普遍发现存在于NSCLC患者外泌体中，参与肿瘤的形成和演化过程。单个miRNA可能通过抑制性复合物与多个mRNA结合，从而阻滞整个生物通路。因此，外泌体的miRNA具有成为NSCLC标志物的优势。Chen等在152例肺癌患者的研究中首次报道了循环游离miRNA的表达，与75例健康者相比，发现了两种高表达的miRNA（miR-25和miR-223）。Rabinonowits等对27例肺癌患者和9例健康人的血浆外泌体中12个miRNA的表达进行了评估，结果显示，12个肿瘤相关的miRNA仅在肺癌患者中过度表达。Cazzoli等收集了30个血浆样本，发现4种外泌体miRNA（miR-378a、-379a、-139-5p、-200b-5p）在肺癌患者血清中明显升高，用于筛查患者与健康人ROC曲线下面积（AUC）为0.908。进一步研究发现，另外6种外泌体（miR-151a-5p、-30a-3p、-200b-5p、-629、-100、-154-3p）可用于肺癌的诊断，其AUC为0.76。这些miRNAs具有NSCLC早期诊断的高度敏感性，有望成为NSCLC早期诊断筛查的生物标志物。

在临床应用方面，目前Exosome Diagnostics公司研发的基于血浆外泌体的ALK试剂盒已于2016年初被美国FDA批准用于临床。这是世界上第一个以血液样本分析外泌体RNA的临床液体活检。这项方法可以准确、实时地检测NSCLC患者的EML4-ALK突变，通过比较NSCLC患者组织ALK水平和相应的血浆样本发现该项检测可以达到88%的诊断灵敏度和100%的诊断特异性。而此前，对于EML4-ALK的检测是基于组织活检的FISH或IHC，而且，FISH缺乏灵敏性，误诊率也较高。

3.2外泌体相关蛋白质与肺癌的诊断

近年来众多文献报道，肺癌细胞分泌的外泌体中富含多种蛋白质并促进肺癌的发生发展，是早期诊断肺癌的有效途径。有研究发现，NSCLC患者肺组织外泌体表面EGFR免疫染色呈阳性的占80%，而慢性肺炎组织的外泌体EGFR呈阳性的只占2%，因而认为外泌体的EGFR蛋白可以用作NSCLC与慢性肺炎鉴别诊断的生物标志物。Park等通过Sys-BodyFlu-id数据库分析发现153种特异性胸腔积液外泌体蛋白质，进一步的Western blotting分析显示多种特异性胸腔积液外泌体蛋白参与EGFR信号传导途径以促进肿瘤的发生发展，因此外泌体蛋白可能作为肺癌诊断筛查的生物学标记物。

近年来，高通量质谱分析被广泛地应用于筛选NSCLC外泌体蛋白的研究，这为我们揭示了更多具有生物标志物价值的分子。Birgitte等采用微阵列芯片技术研究了431例肺癌患者和150例对照者血浆外泌体中的蛋白表达情况，发现CD151、CD171和TSPAN8这三种蛋白表达不仅能区分肿瘤与正常组织，同时也能区分各种肺癌的组织亚型。此外，联合应用这三种蛋白诊断NSCLC的AUC达到0.74。Clark等采用纳升液联用技术（nano-ESI-LC-MS/MS）分析了来自正常支气管上皮细胞系和两个携带NSCLC细胞系的外泌体的蛋白表达谱，从中筛选出如细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、溶酶体膜糖蛋白2等多种存在显着性差异表达的蛋白，同时检测分析这些蛋白有助于提高NSCLC诊断的敏感性和特异性。

4.外泌体在肺癌治疗中的作用

目前外科手术仍是肺癌治疗的最有效方法，但术后复发率很高，而传统放化疗对肺癌的治疗效果又极其有限。因此，肺癌治疗的新模式受到广大研究者的关注，已有大量研究证明外泌体在肺癌治疗中有广阔的应用前景。

外泌体作为细胞间通讯的一种形式，在肺癌的进程中具有重要作用，因此，控制外泌体的分泌可能成为治疗肺癌的潜在靶点。据相关报道称，EPI64可以通过激活特异的GAP和Rab27A来控制A549肺癌细胞的外泌体分泌，提示EPI64可以作为治疗的潜在靶点。此外，CD9、CD63、HSP90和HSP70在外泌体中富集，从而上调主要组织相容性复合物Ⅱ类分子表达水平，显着促进CD4+T细胞的增殖，通过免疫途径抑制肿瘤。理论上，所有促进肺癌细胞分泌外泌体的机制都可以被用来作为肺癌治疗的潜在靶点，但目前关于其可行性的研究还比较少。有研究表明，肿瘤来源的外泌体对肿瘤免疫的调控具有一定的影响作用，包括免疫抑制和免疫激活两个方面。Romagnoli等研究发现，肺癌细胞可以刺激树突状细胞等抗原提呈细胞产生携带特异性癌抗原的外泌体，这些外泌体可以迁移到区域淋巴结，进而激活CD4+T与CD8+T细胞产生抗肿瘤免疫反应，进而抑制肿瘤生长。Besse等研究发现，在晚期NSCLC患者中，装载有IFN-γ，MHC I和MHCⅡ限制性癌抗原的树突状细胞外泌体增强了NK细胞的抗肿瘤免疫功能，研究证实外泌体参与相关肿瘤生理病理过程，在NSCLC免疫治疗中有着重要的临床应用价值，为NSCLC的治疗打开了新的视野。

此外，外泌体作为药物递送载体较以往的合成系统具有多方面的优势，比如：人工递送载体具有更低的免疫原性，其含有的磷脂双分子层可与靶细胞细胞膜融合，从而避免单核巨噬细胞系统的吞噬作用。Srivastava等开发了一种基于外泌体-金奈米粒子（Exo-GNP）的药物递送系统—“nanosomes”用于肺癌的治疗，研究表明该系统与单用多柔比星治疗相比，前者的多柔比星释放量增加、摄取率提高、化疗毒性降低且化疗效果增强。此外，还有研究发现，使用外泌体运载紫杉醇（PTX）可显着提高癌细胞对PTX的吸收，将PTX加载至外泌体中显着增加了药物细胞毒性，Exo-PTX能显着抑制肺癌的发展。Aqil等在进行裸鼠实验时发现，加载至外泌体中的雷公藤红素（Exo-CEL）比普通的CEL有更强的抗肿瘤功效，且在小鼠中未发现明显全身性或系统性毒性，由此可以证明，外泌体制剂可以有效增强CEL功效并降低与剂量有关的毒性。到目前为止，外泌体在肺癌治疗方面的研究主要集中于免疫抑制，有效的外泌体药物递送平台的搭建以及外泌体相关的潜在治疗靶点的探索。已有的研究表明外泌体在肺癌治疗领域有着广阔的前景，期待外泌体在肺癌治疗领域早日得到突破，造福更多的患者。

5.外泌体与肺癌预后

外泌体mirRNA和蛋白质被认为是NSCLC的预后因子。Dejima等在研究NSCLC患者预后的生物标志物时发现，外泌体miR-4257和miR-21的含量显着上升。此外，还有研究表明，低水平miR-146a-5p的NSCLC患者较高水平miR-146a-5p的NSCLC患者有更高的复发率。Sandfeld-Paulsen等在研究276例NSCLC患者血浆的外泌体时发现，NY-ESO-1是唯一对低生存率有显着影响的标志物。Silva等利用TaqMan低密度芯片的方法系统分析了28位NSCLC患者体内的365种miRNA，其中let-7f、miR-30e-3p和miR-20b表达均下调，进一步研究发现，let-7f和miR-30e-3p水平可以区分早期和晚期NSCLC患者，高水平let-7f和miR-30e-3p与不良预后密切相关。

在当代精准医疗的大趋势下，外泌体的发现和研究为肺癌的早期诊断和治疗提供了崭新的方向。外泌体在液体活检中的巨大潜力可以为肺癌患者的早期发现和早期诊疗提供可靠依据。根据肿瘤来源的外泌体在肺癌的发生发展和侵袭转移过程中的作用及相关机制的研究，临床医疗人员可以针对不同的患者制定最合适的治疗方案，以达到改善肺癌患者生存率，延长肺癌患者生存时间的目的。但是，针对外泌体的研究还存在诸多的问题有待广大研究者解决，如：外泌体的纯化及标记方法、如何寻找外泌体的靶基因、外泌体的作用机制及信号通路等。总而言之，外泌体的研究有着广阔的前景，基于外泌体与肺癌的研究，有望研发出能够应用于肺癌临床诊断和治疗的有效措施，造福更多的患者。(生物谷Bioon.com）

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