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Science:中科院高彩霞课题组发现胞嘧啶碱基编辑器引发意想不到的全基因组脱靶突变

来源:本站原创 2019-03-02 16:56

2019年3月2日讯/生物谷BIOON/---在一项新的研究中,中国科学院的高彩霞(Caixia Gao)课题组通过对作为一种重要的作物物种的水稻进行全基因组测序对胞嘧啶碱基编辑器(BE3和HF1-BE3)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)产生的脱靶突变进行全面调查。他们发现胞嘧啶碱基编辑器(BE3和HF1-BE3)诱导全基因组脱靶突变。相关研究结果于2019年2月28日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice”。
图片来自Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences。

单核苷酸变化是人类疾病和经济生物中性状变异的重要原因。通过碱基编辑器对单核苷酸多态性进行基因改造为基因疗法带来了巨大希望,这可能潜在地治愈人类疾病并改善作物植物的性状。

科学家们已开发出胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。这些碱基编辑器是将切口酶型Cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合在一起形成的,并且经发现它们在单向导RNA(sgRNA)的靶位点中促进C>T或A>G转化(即在靶转化)。

尽管CBE和ABE的在靶转化(on-target conversion)在许多有机体中发现,但是它们的脱靶效应并未在全基因组水平上进行过系统性评估。

过去对碱基编辑特异性的分析主要局限于使用计算机软件预测的类似靶标的位点。这些类似靶标的位点通常数量少并且具有有限的基因组分布。

考虑到科学家们已发现大肠杆菌、酵母细胞和人类细胞中的胞嘧啶脱氨酶异位表达会引发全基因组脱氨事件,在全基因组水平上以无偏见的方式探究碱基编辑器的特异性已变得必要和迫切。

在这项新的研究中,高彩霞课题组选择了三种广泛使用的碱基编辑器:BE3、高保真BE3(HF1-BE3)和ABE,其中BE3和HF1-BE3属于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)。将靶向11个基因组位点的总共14个碱基编辑器构造体通过农杆菌转化方法转化到水稻中。他们利用全基因组测序对由BE3、HF1-BE3或ABE编辑的再生T0水稻植物;经过这些碱基编辑器转化但没有经过sgRNA转化的水稻植物以及两个对照组水稻植物(即野生型水稻和转基因水稻的无效分离株)进行分析。

这些碱基编辑器组(即BE3组、HF1-BE3组和ABE组)和对照组在发现的插入或删除(insertion or deletion, indel)数量上没有显著差异。相反之下,BE3组和HF1-BE3组要比ABE组和对照组具有显著更多的单核苷酸变异(SNV)。

在这些碱基编辑器组和对照组中,每株水稻植物的C>T单核苷酸变异(SNV)的平均数量为:203(BE3)、347(HF1-BE3)、88(ABE)和105(对照组)。因此,BE3组和HF1-BE3组水稻植物中的C>T单核苷酸变异数量分别比对照组水稻植物高94.5%和231.9%。

值得注意的是,在没有sgRNA的情况下用BE3和HF1-BE3处理水稻植物也会导致大量的C>T单核苷酸变异。此外,由BE3和HF1-BE3赋予的绝大多数额外C>T突变与使用计算机软件(Cas-OFFinder)预测的脱靶位点并不相匹配。

高彩霞课题组发现所有的单核苷酸变异以及C>T单核苷酸变异分布在整个水稻基因组中,这表明在全基因组发生。利用转录组数据构建的图谱表明与转录的基因区域相比,与BE3和HF1-BE3相关的较高数量的C>T单核苷酸变异更频繁地发生,在这些基因区域,单链DNA因活跃的转录而得以产生。

总而言之,由高彩霞课题组产生的数据表明是BE3和HF1-BE3,而并不是ABE,在水稻中诱导全基因组脱靶突变。这些脱靶突变主要是C>T单核苷酸变异,在转录的基因区域中富集,通过当前的计算机方法是无法预测的。含有胞嘧啶脱氨酶的碱基转化单元可能是由BE3和HF1-BE3引发的较高数量的脱靶单核苷酸变异的原因,因而需要加以优化以提高胞嘧啶碱基编辑器(BE3和HF1-BE3)的特异性。

高彩霞博士说,“碱基编辑器代表了一种吸引人的工具,用于产生植物育种所需的精确遗传变异。这些碱基编辑器的特异性至关重要,这是因为脱靶突变可能是有害的。我们发现当前的BE3或HF1-BE3在植物中导致意外的和不可预测的全基因组脱靶突变,从而凸显了优化这类碱基编辑器特异性的紧迫性。”(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Shuai Jin et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science, 2019, doi:10.1126/science.aaw7166.
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