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2018年12月CRISPR/Cas最新研究进展

来源:本站原创 2018-12-31 23:53

2018年12月31日/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

2018年11月26日,中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改,使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵,引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究,但是更多的是质疑,甚至是谴责。

即将过去的12月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。

1.Nucleic Acids Res:揭示CRISPR-Cas9基因编辑为何遭遇失败
doi:10.1093/nar/gky1216


如今,在一项新的研究中,来自荷兰代尔夫特理工大学的研究人员鉴定出一种当CRISPR-Cas9使用不当时导致这些不需要的突变产生的机制。这可能导致休眠的基因表达,因而可能是非常危险的。基于这一发现,他们构建出一个检查清单。使用这个检查清单将会这种有害机制激活,并且让利用CRISPR-Cas9进行基因编辑变得更加安全。相关研究结果近期发表在Nucleic Acids Research期刊上,论文标题为“Allele-specific genome editing using CRISPR–Cas9 is associated with loss of heterozygosity in diploid yeast”。
图片来自Nucleic Acids Research, doi:10.1093/nar/gky1216。

与很多有机体一样,人类细胞含有的每条染色体都存在两个拷贝:一个拷贝来自父亲,另一个拷贝来自母亲。这些染色体拷贝几乎是完全相同的,但是它们在许多基因中存在着很小的差异。这些较小的变化导致不同个体之间的遗传差异。对每条染色体而言,存在一个备份可能听起来像是一件好事。然而,这些研究人员发现当与基因编辑工具CRISPR-Cas9相结合时,这会引起问题。论文通讯作者Jean-Marc Daran博士说,“当将CRISPR-Cas9用于靶向人类等杂合有机体中的单条染色体时,一种自然修复机制就会被激活。事实证实这种机制使用这条染色体的另一个拷贝作为修复它的DNA的模板。”

通常情形下,使用CRISPR-Cas9的基因编辑专家能够通过引入一段新的DNA序列来改变细胞的部分基因组。Cas9蛋白在靶位点上切割DNA,之后细胞有望使用这段新的DNA来修复它的DNA。因此,新的基因就能够被引入。Daran说,“当然,当这种修复机制使用另一条染色体而不是这段新引入的DNA作为模板时,基因编辑将不会取得成功。”由于利用另一条染色体进行DNA修复的效率更高,利用预期的DNA片段进行DNA修复几乎从不会发生。更糟糕的是,杂合性丢失也可能会发生,这会导致严重的健康后果。处于休眠状态的致病基因---比如导致癌症的基因---可能会表达。

2.Cell子刊:使用CRISPR-Cas9可恢复化疗药物治疗肺癌的疗效
doi:10.1016/j.omto.2018.10.002


肺癌中的一些基因有助于这种癌症对用来治疗它的一线化疗药物产生耐药性。在一项新的研究中,来自美国克里斯蒂安娜卫生保健系统和特拉华大学的研究人员发现CRISPR-Cas9基因编辑系统可能能够通过剔除或“敲除”肺癌中的一个称为NRF2的基因来恢复这些化疗药物的疗效。相关研究结果发表在2018年12月21日的Molecular Therapy-Oncolytics期刊上,论文标题为“Functional Gene Knockout of NRF2 Increases Chemosensitivity of Human Lung Cancer A549 Cells In Vitro and in a Xenograft Mouse Model”。

这项研究报道在组织培养物和小鼠中,当将化疗药物与用来让肿瘤基因NRF2失去功能的CRISPR-Cas9组合使用时,肿瘤生长停止,而且现存肿瘤的体积显著减少。以前的研究已表明NRF2基因控制着肺癌肿瘤中的细胞功能,这有助于它们阻止化疗药物的疗效,不然这些化疗药物可能会减少或完全消除它们。

3.Eur J Neurosci:经过CRISPR/Cas9n编辑的干细胞有望治疗帕金森病
doi:10.1111/ejn.14286


在英国,帕金森病的发病率大约为1/350。在一项新的研究中,来自英国爱丁堡大学和UCB制药公司(UCB Pharma Ltd.)的研究人员在改善一种新出现的治疗帕金森病的方法上迈出了关键一步。这一进展可能有助于开发一种有希望的称为细胞替代疗法(cell replacement therapy)的疗法。专家们希望这种涉及将健康细胞移植到被帕金森病破坏的大脑区域中的疗法能够缓解震颤和平衡问题等症状。相关研究结果近期发表在European Journal of Neuroscience期刊上,论文标题为“Engineering synucleinopathy‐resistant human dopaminergic neurons by CRISPR‐mediated deletion of the SNCA gene”。

在这项新的研究中,这些研究人员构建出对帕金森病有抵抗力的人胚胎干细胞(hESC)。具体而言,他们利用一种称为CRISPR/Cas9n的先进技术切除hESC中的DNA片段。在这样做的过程中,他们剔除了与有毒性的团块(称为路易小体)形成相关的基因SNCA,其中这种毒性团块形成是帕金森患者中的脑细胞的一种典型特征。

在实验室测试中,这些干细胞在培养皿中可被转化为产生多巴胺的神经元。它们随后在接受一种化学试剂处理后就可导致路易小体形成。这些研究人员发现相比于未经过基因编辑的神经元,经过基因编辑的神经元并没有形成有毒性团块。

4.ChemBioChem:利用CRISPR/Cas9发现一种新的抗生素---极光霉素
doi:10.1002/cbic.201800266


玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)是诸如达托霉素(daptomycin)之类的许多常见抗生素的来源,其中达托霉素具有抵抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐糖肽类抗生素肠球菌(glycopeptide-resistant enterococci)的活性。
图片来自ChemBioChem, doi:10.1002/cbic.201800266。

如今,在一项新的研究中,来自新加坡科技研究局(A*STAR)的研究人员通过激活玫瑰孢链霉菌基因组中发现的一个沉默的生物合成基因簇,发现了一种新的抗生素---极光霉素(auroramycin),并且相信还有更多的抗生素等待人们去发现。相关研究结果近期发表在ChemBioChem期刊上,论文标题为“Auroramycin: A Potent Antibiotic from Streptomyces roseosporus by CRISPR‐Cas9 Activation”。论文第一作者为新加坡科技研究局化学与工程科学研究所的Yee Hwee Lim和新加坡科技研究局化学工程实验室的Fong Tian Wong。

Lim、Wong及其同事们使用CRISPR-Cas9将一个有效的基因转录激活子--- kasO*启动子--- 导入到这种细菌基因组中,从而激活这个沉默的生物合成基因簇的表达。他们发现这个基因簇编码极光霉素,即一种对革兰氏阳性菌具有强效抗菌活性的抗生素。

5.PLoS Pathog:吉林大学欧阳红生课题组利用CRISPR/Cas9和RNAi开发出抵抗猪瘟病毒的转基因猪
doi:10.1371/journal.ppat.1007193


在一项新的研究中,我国吉林大学的欧阳红生(Hongsheng Ouyang)课题组培育出免受猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)感染的转基因猪。正如这些作者所指出的那样,这些转基因猪要比商业上的疫苗接种具有潜在的益处,并且可能降低与猪瘟相关的经济损失。相关研究结果于2018年12月13日发表在PLoS Pathogens期刊上,论文标题为“Genetically modified pigs are protected from classical swine fever virus”。

CSFV导致一种高度传染性的通常是致命性的疾病,从而造成严重的经济损失。鉴于这种病毒对养猪业的经济重要性,CSFV的生物学特征已受到广泛研究。尽管许多政府努力消除猪群中的这种疾病,但是它仍然普遍存在,而且这种病毒再次入侵并导致下一轮疾病爆发只是时间问题。人们迫切需要开发根除CSFV的有效方法。为了应对这一挑战,欧阳红生课题组通过将一种称为CRISPR/Cas9的基因编辑工具与RNA干扰(RNAi)相结合,产生了抵抗CSFV的转基因猪。他们证实,这些转基因猪能够有效地限制CSFV复制并降低与CSFV相关的临床症状和死亡率。此外,这种抗病能力能够稳定地传递给它们的第一代后代。

6.Science:CRISPRa加入肥胖之战,无需对基因组进行编辑就能对抗肥胖
doi:10.1126/science.aau0629


在一项重要的新研究中,来自美国加州大学旧金山分校的研究人员证实CRISPR疗法可以在不切割DNA的情况下减少体内的脂肪。他们利用一种经过修饰的CRISPR版本提高某些基因的活性,从而阻止携带着导致极端体重增加易于发生的基因突变的小鼠出现重度肥胖。重要的是,他们实现了持久的体重控制,而无需对小鼠基因组进行一次基因编辑。相关研究结果于2018年12月13日在线发表在Science期刊上,论文标题为“CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency”。

基因SIM1或MC4R---两个在调节饥饿和饱腹感中起着至关重要作用的基因---的单个拷贝发生突变在重度肥胖患者中是经常观察到的。当这些基因的两个拷贝都起作用时,人们通常能够控制他们的食物摄入。但是基因突变能够让其中的一个拷贝失去功能,这迫使人体完全依赖于单个正常的基因拷贝,然而这个正常的基因拷贝本身无法足够地发出饱食信号,这就使得受到影响的个人具有无休止的食欲。结果就是他们无法控制他们的食物摄入并最终导致重度肥胖。但是,CRISPR技术取得的最新进展可能提供一种治疗方案。
CRISPRa示意图,图片来自ACS Chem Biol. 2018 Feb 16;13(2):406-416。

在这项新的研究中所涉及的这种技术是一种称为CRISPR介导激活(CRISPR-mediated activation, CRISPRa)的技术。它是由加州大学旧金山分校细胞与分子药理学教授Jonathan Weissman博士及其团队开发出来的,它与常规CRISPR的不同之处在于它不会对宿主基因组进行切割。它保持了常规CRISPR的引导系统,这种引导系统经编程后能够靶向特定的DNA序列,但是将与一串短肽(即SunTag array)融合在一起的没有切割活性的Cas9(dCas9)替换常规CRISPR中的有切割活性的Cas9。当CRISPRa找到其靶DNA序列时,这一串短肽能够在细胞中招募转录激活因子,从而促进特定基因表达,但是没有发生基因编辑。

接受CRISPRa治疗的小鼠在体重上要比未治疗的小鼠减轻30%至40%。这种效果也是持久性的。这些研究人员对这些小鼠进行了10个月的监测---这是小鼠正常寿命的一小部分---并且发现那些接受CRISPRa单次治疗的小鼠在监测期间保持了健康的体重。

7.Science:重大进展!揭示功能多样化的V型CRISPR-Cas系统
doi:10.1126/science.aav7271


在一项新的研究中,来自美国Arbor生物技术公司(Arbor Biotechnologies)的研究人员鉴定出Cas12蛋白的其他成员:Cas12c、Cas12g、Cas12h和Cas12i展现出RNA引导的双链DNA(dsDNA)干扰活性。Cas12i对crRNA间隔序列的互补链和非互补链表现出显著不同的切割效率,从而主要导致dsDNA切口。作为一种核糖核酸酶(RNase),Cas12g表现出RNA指导的靶向切割RNA活性,此外还附带具有非特异性地反式切割单链DNA(ssDNA)的活性。

这项研究揭示出V型CRISPR-Cas的不同进化途径中出现多能多样性,这会扩展CRISPR工具箱。

8.Circulation:基因编辑有助于治疗家族性心肌病
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.118.035028


一年多前,一名患有严重肥厚性心肌病的65岁女性 - 心脏肌肉异常变厚,可能导致危险的心律不齐 - 在她第一次访问宾夕法尼亚中心之前对她的基因进行了测序心脏病。在序列中,患者的护理团队确定了一种名为TNNT2的基因变异,该基因与此类心脏病的发生有关。由心血管医学和遗传学副教授Kiran Musunuru,医学博士和心血管医学助理教授Anjali Tiku Owens领导的团队希望找出该变异是否可以解释她的心脏病的发生,以及能否用于检测该疾病的遗传性。为此,该团队使用了他们正在开发的基于干细胞的检测方法,为患者及其家人提供高度个性化的检测。

在2017年患者第一次和第二次访问诊所之间的10周内,Penn团队使用Musunuru实验室开发的新基因编辑技术快速生成含有患者特异性TNNT2基因变异的诱导多能干细胞。这些定制的干细胞 - 个性化的化身,显示出对诱导心脏细胞更快跳动的化学物质的正常反应,表明该变体不是引起疾病的。在这一发现的指导下,研究小组建议患者家属不要进行基因筛查,但未来仍可能会对心脏壁增厚进行监测。

作为测试开发的一部分,该团队创建了TNNT2基因变体文库,并分离出14种独特类型。根据新的分析,其中大多数被归类为致病性或致病性。该平台允许使用CRISPR和其他基因编辑工具的组合将特定基因变体快速插入干细胞中。然后诱导含有患者独特的TNNT2变体的遗传化身成熟为心肌细胞,以测试它们对肾上腺素样化学物质的反应。结果显示来自Owens'患者的TNNT2变体是良性的。

使用同样的方法,该团队将能够确定哪些变体是中性的,哪些变体对其他患者有潜在危害。该平台相对于先前技术的显着优点是它可以用于同时研究许多不同的患者变体,可能在单个实验中与所有4,000种可能的TNNT2基因变体一样多。

9.Cell:科学家有望调整基因编辑工具CRISPR 改善其工作效率
doi:10.1016/j.cell.2018.10.045


近日,一项刊登在国际杂志Cell上的研究报告中,来自诺和诺德基金会中心的科学家们通过研究阐明了一种CRISPR技术—Cas12在分子水平下的工作机制,其或许就能能基因编辑过程进行调整来达到特定的预期效果。研究者Guillermo Montoya教授说道,如果我们把CRISPR比作是汽车发动机的话,我们要做的就是对这个 发动起进行3-D图谱的绘制,并深入理解其作用机制,这将能帮助我们调节CRISPR引擎,并使其在多方面发挥作用。
图片来源:CC0 Public Domain。

文章中,研究人员利用一种所谓的低温电子显微镜(cryoEM)来绘制该技术的图谱,最近哥本哈根大学建成的cryoEM“工厂”就能够建立一套先进的技术,以此来促进研究人员在CRISPR-Cas12a切割DNA链时拍摄分子的形状,同时研究人员还能将该技术与名为单分子荧光共振能量转移(FRET)技术相结合使用,后者能直接观察到分子的运动以及每一种蛋白的序列事件。

除此之外,这一系列事件也向研究人员揭示了CRISPR工具的三个部件,这些工具都能够改变形状才能够准确切割DNA。研究者Nikos Hatzakis教授说道,我们的研究结果表明,基因组所发生的一系列精确事件就会导致基因编辑的发生,这三个部件的工作原理类似于机场的安检,你必须按照正确的顺序完成所有的检查。

10.Nat Biotechnol:最大规模CRISPR/Cas9突变研究构建出基因编辑预测工具
doi:10.1038/nbt.4317


CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术,能够让人们在基因组的任何位置切割DNA,从而产生突变和关闭特定基因。全世界的科学家都在使用这项重要技术来研究哪些基因对各种疾病(从癌症到罕见疾病)都很重要。如今,人们正在利用它开展治疗性林场试验,以便校正人类基因中的有害突变。特异性的向导RNA(gRNA)与精确的靶DNA序列结合,从而将Cas9“剪刀”引导到合适的DNA位点上。然而,人们很难预测最终的突变将会是什么样子,这是因为当细胞修复DNA双链断裂将DNA的两个切割末端重新连接在一起时,这通常会导致进一步的变化发生。

为了研究这一点,在一项迄今为止最大规模的探究CRISPR作用机制的研究中,来自英国威康基金会桑格研究所的研究人员构建出4万多对不同的靶DNA和gRNA,并执行CRISPR-Cas9基因编辑。通过对不同细胞中的每对靶DNA和gRNA进行深度测序,他们能够详细地分析DNA是如何被切割和重新连接在一起的。他们发现这种DNA修复依赖于靶DNA和gRNA的精确序列,并且发现在相同的序列中,这是可重复的。相关研究结果于2018年11月27日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Predicting the mutations generated by repair of Cas9-induced double-strand breaks”。论文通讯作者为威康基金会桑格研究所的Leopold Parts博士。论文第一作者为威康基金会桑格研究所的Luca Crepaldi博士和Felicity Allen博士。

这些研究人员随后利用大量的序列数据开发出一种机器学习计算工具,该工具创建了确定DNA修复结果的一般规则。这种称为FORECasT的程序能够让他们仅使用靶DNA序列来预测修复后的DNA序列。

这项研究是迄今为止对CRISPR-Cas9作用机制进行了最大规模和最全面的研究,分析了一亿多个DNA序列,这就使得研究这个基因编辑过程成为可能。这些研究人员正是细胞以细胞的方式修复特定的靶序列,这就表明细胞的这种修复机制是可重复的。(生物谷 Bioon.com)

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