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UBL3影响蛋白质向小型胞外囊泡转化

来源:生物之家 2018-12-27 09:21

 

外泌体是一种小型胞外囊泡(sEVs),来自于多泡体(MVBs),通过运输蛋白质、mRNA和miRNA介导细胞间的通信。然而,哪类蛋白质被归为sEVs的分子机制还不是完全清楚。在这里,作者报道了泛素样3(UBL3)膜锚定的Ub折叠蛋白MUB作为翻译后修饰因子PTM调节蛋白向胞外囊泡转化。作者发现UBL3的修饰对于将UBL3归类到MVBs是不可缺少的。同时作者还发现从UBL3缺失型小鼠样本中纯化的sEVs总蛋白,与野生型小鼠相比减少60%,并从蛋白质组学分析结果中发现了1241个与UBL3互作蛋白,包括Ras。作者展示了UBL3改变Ras基因和致癌基因RasG12V突变体,UBL3的表达促进RasG12V到sEVs的转变。综上所述,结果表明PTM被UBL3取代并影响蛋白到sEVs的归类转化。

研究内容及结果

1. UBL3作为转录后调控因子的分析

目前对于UBL3作为PTM转录后调节因子的作用还不清楚,为了明确这一调控机制,作者在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过表达带Flag的Flag-UBL3(16kDa),并通过免疫共沉淀纯化UBL3蛋白。有趣的是,在过表达Flag-UBL3细胞中,UBL3条带出现弥散现象,并在样品装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前添加2-mercaptoethano(βME+)后信号消失。为了验证UBL3修饰确实发生在体内,作者建立了UBL3敲除小鼠,并在脑组织(此组织UBL3高表达)中分析PTM,发现PTM表达下降。作者同时构建了UBL3C113/114突变,检测发现不仅在MDA-MB-231细胞中,在每一个所检测的细胞中UBL3均不表达。但在UBL3C113A和UBL3C114A突变体中,UBL3修饰表达虽降低但仍能检测到其表达。

2. UBL3向MVBs和sEVs转化过程中UBL3的修饰不可缺少

作者通过免疫荧光检测UBL3的亚细胞定位,发现细胞质中UBL3修饰程度下降。接着构建UBL3加EGFP荧光,并与MVBs的标记物CD63进行融合分析,进一步验证UBL3在MVBs多泡体中富集。为进一步证明MVBs多泡体中UBL3修饰与定位,作者检测了UBL3C113A、UBL3C114A、UBL3C113/114A及UBL3△1与CD63融合分析,与野生型UBL3检测不同,野生型的未见到与CD63融合。为了了解UBL3在多泡体及膜中的定位,作者又进一步安排了免疫电镜检测。将加了Flag标签的UBL3质粒转染进MDA-MB-231细胞后,UBL3在MVBs及质膜中表达清晰,在线粒体及核膜中未检测到表达。其中UBL3△1主要定位于质膜,不在MVBs中。这些结果显示UBL3修饰在MVBs形成中是必须的。

3. UBL3敲除小鼠中外泌体中总蛋白下降,UBL3修饰影响蛋白向胞外分泌

作者在前期的研究中发现,MVBs更多的倾向于分泌成胞外囊泡EVs,将MDA-MB-231细胞分泌上清分别在2000×g(2K)离心力、10000×g(10K)离心力及100000×g(100K)离心力下离心,发现在100k离心力下UBL3富集程度最高。通过对构建的UBL3敲除小鼠与正常小鼠进行蛋白质组学定量分析,发现UBL3敲除小鼠中外泌体总蛋白含量比野生型降低60%。

为更好的了解UBL3修饰后其生理功能,作者进行了全面的蛋白质组学研究分析,UBL3互作蛋白依赖于两个C端半胱氨酸残基的方式。同时作者发现在与UBL3互作的蛋白中至少有22个与疾病相关的分子,包括与肿瘤形成、代谢、转移等相关,例如HRAS、KRAS、TGFBR1、TGFBR2、RB1、ITGA6、ITGB4、mTOR、TSC2及APLP2。同时发现与免疫应答相关的分子mTOR、RPTOR及TSC2,Notch信号分子NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3等。为检测UBL3是否经外泌体形式引起受体细胞中Ras信号激活,作者将从经RasG12V转染的MDA-MB-231细胞上清中提取的经PKH67包被的外泌体与细胞共孵育,检测磷酸化ERK的表达情况,结果发现,相比于从UBL3C113/114A及RasG12V共转染后提取外泌体孵育组,磷酸化的ERK(pERK)在经野生型UBL3及RasG12V共转染后外泌体孵育组pERK表达明显上调。UBL3修饰诱导了RasG12V到外泌体sEVs转化过程中Ras信号的激活,UBL3作为一个类似于标签的作用向sEVs传递蛋白。

文章小结

1.通过研究数据表明UBL3通过C端半胱氨酸残基二硫键结合靶蛋白,尽管UBL3有泛激素类似的区域,但UBL3修饰与传统泛激素作用不同。

2. 作者证明了UBL3修饰在UBL3向MVBs及sEVs转化过程中起重要作用。检测到1241个与UBL3C端半胱氨酸残基互作蛋白,其中29%被注释为胞外泌体,同时发现UBL3敲除小鼠中外泌体蛋白总量降低60%,显示UBL3极大可能参与过半的外泌体蛋白归类过程。UBL3与特定蛋白的结合是短暂的,只有UBL3修饰后蛋白在细胞裂解过程中稳定存在。

3. 外泌体sEVs中的特异性蛋白在肿瘤的生长发生及转移过程中其中重要的作用。本文中作者通过蛋白质组学确定了1241个依赖于两个C端半胱氨酸残基结合与UBL3互作的蛋白,其中包括了至少22个疾病相关分子,影响pERK磷酸化蛋白的表达。因此,抑制UBL3修饰可能成为与Sev相关疾病的治疗靶点,具有潜在的影响。(生物谷Bioon.com)

 

 

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