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2018年9月CRISPR/Cas最新研究进展

来源:本站原创 2018-09-30 22:39

2018年9月30日/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

即将过去的9月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。

1.Nat Biotechnol:将细菌基因组致病岛改造成一种抗葡萄球菌神器
doi:10.1038/nbt.4203


金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)通常对抗生素产生耐药性,因而对安全的医院护理构成威胁。在一项新的研究中,来自美国纽约大学医学院的研究人员发现,从病毒进化而来的基因组“岛屿(islands)”能够转化为阻止金黄色葡萄球菌感染的抗菌“无人机(drones)”。相关研究结果于2018年9月24日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Conversion of staphylococcal pathogenicity islands to CRISPR-carrying antibacterial agents that cure infections in mice”。 他们发现某种类型的细菌DNA经基因改造后能够让杀死或致残细菌的基因替换致病性基因。
图片来自Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.4203。

这种研究中着重关注的这种类型的细菌DNA是一种“致病岛(pathogenicity island, 也译作毒力岛)”,它是从病毒中进化而来的,并且永久地停留在病毒感染的细菌中,成为其遗传系统的一部分。结果就是形成一种混合实体(hybrid entity),这种混合实体含有细菌在繁殖时传递给后代的有用基因,但在某些情况下也会切除细菌上层结构,并像病毒一样被包装在蛋白外壳(衣壳)中,这样就将它的DNA注射到其他的细菌细胞中。

这些研究人员表示,这种进化飞跃的混合体将基因组岛屿塑造成完美的类似于无人机的载体,为细菌群体运送基因载荷(genetic payload)。当通过注射让小鼠遭受致命性的葡萄球菌感染时,他们进行基因改造过的金黄色葡萄球菌致病岛(SaPI)杀死了这些细菌并拯救了这些遭受感染的小鼠。

2.Nature子刊:利用经过CRISPR基因编辑的皮肤贴片阻止可卡因过量吸食
doi:10.1038/s41551-018-0293-z


有尼古丁贴片(nicotine patch)来帮助戒烟,随后还有这个:皮肤贴片,经基因改造后产生一种消化可卡因的酶,并且当被移植到小鼠身上时,它们让这些小鼠抵抗致死剂量的可卡因。在一项新的针对这种皮肤贴片策略的研究,来自美国芝加哥大学的研究人员希望这可能有朝一日能够导致一种治疗人类成瘾和阻止可卡因过量吸食的方法。相关研究结果于2018年9月17日在线发表在Nature Biomedical Engineering期刊上,论文标题为“Genome-edited skin epidermal stem cells protect mice from cocaine-seeking behaviour and cocaine overdose”。论文通信作者为芝加哥大学干细胞研究员Xiaoyang Wu和芝加哥大学成瘾研究员Ming Xu。

Wu团队之前曾使用CRISPR基因编辑技术,用表达胰岛素的细胞为糖尿病小鼠制造出一种皮肤贴片,他想知道这种策略是否也适用于可卡因成瘾。根据一项调查,90多万美国人滥用这种药物。因此,Wu与Xu合作开展实验。

人类天然地会产生一种被称作丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase)的酶,这种酶能够降解可卡因,但是这些研究人员想要让他们的皮肤移植物能有更强大的功能。因此,他们使用了另一个研究团队已设计出的这种酶的增强形式,它降解可卡因的活性是这种酶原始形式的4400倍。他们利用CRISPR将编码这种酶加强形式的基因插入到小鼠的皮肤表皮干细胞中,将这些细胞接种到1厘米宽的圆形支架上,然后将所形成的组织(即皮肤贴片)移植到对可卡因上瘾的小鼠身上。

存在的一个问题是这种技术是否能够像相对较小的胰岛素那样,让相对较大的经过修饰的丁酰胆碱酯酶进入血液。不过这个实验取得了成功:在移植两周后,一剂原本会致命的可卡因对小鼠没有明显的影响---显然,这种酶在这种药物(如果有的话)的大多数能够达到小鼠的大脑之前就会将它降解掉。之前对可卡因上瘾的小鼠在接受这种皮肤贴片移植后不再表现出对它们所在的封闭空间中的一个区域的偏好性,这是它们学会了将这个区域与可卡因摄入相关联在一起。在移植10周后,这种皮肤贴片继续产生这种酶直至实验结束。

3.Science:重大进展!构建出增加基因组靶向范围的CRISPR/Cas9系统
doi:10.1126/science.aas9129


在CRISPR/Cas9系统中,酶Cas9在DNA靶位点上进行切割,其中这种靶位点是这样确定的:一种被称作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起,形成嵌合RNA(tracrRNA/crRNA),然后,借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对,以这种方式,这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时,人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA, sgRNA),并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割,其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。
图片来自Frontiers in Genetics, 24 September 2015, doi:10.3389/fgene.2015.00300。

此外,CRISPR/Cas9系统靶向识别和切割与前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)相邻的特定DNA位点。作为一种最为频繁用于基因组编辑的Cas9酶,来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)仅识别作为PAM的NGG序列(简称NGG PAM,其中N代表任何一种碱基),这就限制了基因组中能够被靶向的区域。

在一项新的研究中,为了解决这个限制,来自日本东京大学、庆应义塾大学、大阪大学和美国布罗德研究所、麦戈文脑研究所和麻省理工学院的研究人员构建出一种合理设计的SpCas9变异体(SpCas9-NG),它能够识别NG而不是NGG。这种SpCas9-NG变异体增加了基因组中的靶向范围,但是具有与野生型SpCas9类似的特异性。晶体结构揭示出与第三个碱基之间的碱基特异性相互作用的丧失得到新引人的非碱基特异性相互作用的补偿,从而能够识别作为PAM 的NG序列(NG PAM)。

这些研究人员进一步证实在人细胞中,这种SpCas9-NG变异体在携带着NG PAM的内源性靶位点中诱导碱基插入或删除(insertion or deletion, indel)。

最后,这些研究人员还发现将这种SpCas9-NG变异体与活化诱导的胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)融合在一起能够调节人细胞中携带着NG PAM的靶位点上的C→T转化,即由碱基胞嘧啶(C)转化为碱基胸腺嘧啶(T)。

4.Cell:首次解析出CRISPR-Cas13d的三维结构,有助揭示它的RNA靶向机制
doi:10.1016/j.cell.2018.09.001


如今,在一项新的研究中,来自美国沙克生物研究所的研究人员首次解析出CRISPR-Cas13d的详细分子结构。CRISPR-Cas13d是新兴的RNA编辑技术中的一种有希望的酶。他们能够利用低温电镜技术(cryo-EM)可视化观察这种酶,其中cryo-EM是一种前沿的技术,让人们能够以前所未有的细节捕捉复杂分子的结构。相关研究结果发表在2018年9月20日的Cell期刊上,论文标题为“Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d”。论文通信作者为沙克生物研究所的Patrick D. Hsu和Dmitry Lyumkis。论文第一作者为沙克生物研究所的Cheng Zhang和Silvana Konermann。

在这项新的研究中,这些研究人员通过让CRISPR-Cas13d在不同的动态状态下冻存,并利用cryo-EM解析出这种酶的新的结构细节,从而能够破解它的一系列活性,而不是仅在一个时间点观察到一种活性。

5.Nature:重大突破!发现环状核酸酶通过降解环状寡腺苷酸让III型CRISPR/Cas系统失活
doi:10.1038/s41586-018-0557-5


在一项新的研究中,来自苏格兰圣安德鲁斯大学的研究人员鉴定出CRISPR基因组工程工具包中的一个重要的新组分。这将引发遗传病和感染治疗变革。相关研究结果于2018年9月19日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Ring nucleases deactivate type III CRISPR ribonucleases by degrading cyclic oligoadenylate”。论文通信作者为圣安德鲁斯大学生物学院生物医学科学研究中心的Malcolm White教授,论文第一作者为圣安德鲁斯大学的Januka S. Athukoralage和Christophe Rouillon。
图片来自Nature, doi:10.1038/s41586-018-0557-5。

人类利用干扰素途径来发出感染存在的信号并调动体内的防御。最近,科学家们发现了CRISPR系统的一个意外方面:入侵病毒的遗传物质触发了环状分子的合成。这些环状分子是由4或6个腺苷一磷酸(AMP)分子连接在一起而形成的,而且与干扰素一样,是让细胞进入抗病毒状态的信号分子。它们通过激活一系列破坏入侵病毒并提供免疫力的降解酶来做到这一点。但是,如果长时间处于激活状态的话,细胞也会死亡。为了避免这种命运,人们预测细胞具有分子“关闭开关(off switch)”,一旦感染被清除,这种“关闭开关”就会清除这些环状分子。

当开始研究时,Athukoralage着手寻找这种难以捉摸的“关闭开关”。他成功地纯化出一种酶,他命名为“环状核酸酶(ring nuclease)”,它特异性地降解环状分子。通过与来自圣安德鲁斯大学生物学院生物医学科学研究中心的同事们合作,他展示了这种环状核酸酶如何结合并切割环状分子,从而证实一旦病毒遭受破坏,这种“关闭开关”如何让细胞恢复到未受感染的状态。

6.Nat Microbiol:CRISPR筛选技术能够找到抵抗黄病毒感染的关键基因
doi:10.1038/s41564-018-0244-1


最近,来自西南医学中心的研究人员首次使用CRISPR全基因组筛选手段鉴定出一种有助于细胞抵抗黄病毒感染的基因。黄病毒是一类令人讨厌的病原体,其中包括西尼罗河病毒,登革热,寨卡病毒和黄热病。在这项发表在《Nature Mircobiology》杂志上的一项研究中,John Schoggins博士领导的研究小组利用CRISPR技术鉴定出IFI6基因是一种靶向黄病毒的强效抗病毒基因。之后,研究人员利用传统的细胞试验证实该基因在防止寨卡病毒,西尼罗河病毒,登革热病毒和黄热病病毒感染方面的作用。

Schoggins博士称,他们最近开发的全基因组CRISPR筛选技术能够帮助确定哪种干扰素诱导的基因在抑制黄病毒感染方面发挥了重要作用。“我们对IFI6如何抑制黄病毒进行了相关的表型和机制研究,同时通过CRISPR筛选,使我们能够找到IFI6这一抑制黄病毒感染的因子”,作者说到。

在细胞培养研究中,作者发现IFI6基因表达的蛋白质能够有效抑制肝脏中黄热病的感染,同时能够抑制登革热,寨卡病毒和西尼罗河病毒的感染。研究人员通过在肾脏和皮肤细胞系以及神经元中重复实验证实了上述结果。

7.Nature:重磅!新研究使得在体内进行CRISPR/Cas9精准基因组编辑成为可能
doi:10.1038/s41586-018-0500-9


在临床中使用CRISPR/Cas9基因编辑的一个障碍是Cas9核酸酶可能会在错误的位点上切割DNA。在一项新的研究中,来自美国麻省总医院和英国阿斯利康公司的研究人员描述了一种在整个基因组中预测这些脱靶突变的策略,并且在小鼠中证实经过精心设计的向导RNA(gRNA)链不会产生任何可检测到的切割错误。相关研究结果于2018年9月12日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations”。论文通信作者为阿斯利康公司生物学家Marcello Maresca和麻省总医院生物学家与病理学家J. Keith Joung。

为了开发出一种让脱靶效应最小化的方法, Maresca团队与Joung团队合作。他们开发出的这种方法的第一部分---最初由Joung团队开发并于2017年发表(Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.4278)---是在体外完成的。首先,他们将基因组DNA ---在这项新的研究中,他们用的是小鼠基因组---切割为大约长300个碱基对的片段,随后给这些片段连接上一系列让DNA环化的接头(adapter)。他们引入Cas9和gRNA的复合物,这种复合物在某些位点上切割环状DNA,从而让它线性化。

另一批核酸酶会降解剩余的未被切割的环状DNA。通过这种方式,这些研究人员能够对线性化的DNA进行测序,以便观察Cas9切割(不论是有意的还是无意的)的位点并预测gRNA是否会导致体内脱靶效应。

作为在这项新的研究中开发出的这种方法的第二部分,这些研究人员在小鼠中测试了他们的预测结果。当他们使用他们在体外发现的会在基因组中数千个错误位点进行切割的gRNA时,在他们检查的一部分的预测位点中,超过40%的位点也在小鼠肝脏中发生突变。一个位点在体外筛选中出现的频率越高,它在体内发生突变的可能性就越大。换句话说,在体外发生差错的gRNA在体内也会发生差错。

这些研究人员还在体内实验中检查了小鼠基因组中的通过计算预测可能为脱靶位点但是迄今为止并未在他们的体外筛选过程中出现的位点。他们并没有在这些位点上检测到突变,这意味着他们的体外方法可能不会错过真正的脱靶位点。

8.PNAS:核小体或会抑制“基因魔剪”CRISPR-Cas9的切割效率
doi:10.1073/pnas.1810062115


近日,一项刊登在国际杂志Proceedings of the National Academy of Sciences上的研究报告中,来自犹他大学的科学家们通过研究发现,核小体会抑制CRISPR/Cas9的切割效率,文章中,研究人员描述了如何在酵母样本中检测相关的基因编辑技术以及他们的研究发现。

“基因魔剪”CRISPR/Cas9能够利用导向RNA来寻找并且切割DNA片段,但当靶向片段是核小体的一部分会发生什么呢?此前研究人员通过研究发现,在这种情况下,似乎CRISPR/Cas9的切割效率会被降低;这项研究中,研究人员通过对这种情况进行体内试验发现,此前的研究结果是正确的,即利用CRISPR/Cas9切割核小体或许会降低其作用效率。

文章中,研究人员利用CRISPR/Cas9技术对活酵母中不同的导向RNAs进行编辑,这就能够实现对不同靶点的编辑。研究者表示,相比非核小体的区域而言,当对核小体区域进行编辑时,CRISPR/Cas9的编辑效率会发生降低;当研究人员对诸如锌指等基因编辑技术进行监测时,他们并未发现任何差异,后期研究人员或将进行更为深入的研究来改善CRISPR/Cas9对核小体区域进行基因编辑的效率。

9.重磅!两篇Science首次发现阻断CRISPR/Cas12a的抗CRISPR蛋白
doi:10.1126/science.aau5138; doi:10.1126/science.aau5174


在两项新的研究中,两个研究团队利用生物信息学方法鉴定出阻断Cas12a的抑制蛋白。尽管过去的研究已鉴定出几种阻断Cas9的抑制剂,但是这些抑制Cas12a的蛋白是迄今为止已知的首批阻断Cas12a的蛋白。相关研究结果于2018年9月6日在线发表在Science期刊上,论文标题分别为“Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors”和“Discovery of widespread Type I and Type V CRISPR-Cas inhibitors”。
在第一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员利用一种全面的生物学信息学和实验筛选方法鉴定出三种阻断或减少在人细胞中进行CRISPR/Cas12a介导的基因组编辑的抑制剂。他们还发现CRISPR自我靶向和抑制剂出现率在原核生物基因组中存在广泛的关联性,这提示着一种从微生物世界中发现更多的Acr蛋白的直接途径。
图片来自Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.12.038。

在第二项新的研究中,来自美国加州大学旧金山分校、麻省总医院和哈佛医学院的研究人员发现了12个Acr基因,这些基因编码的Acr蛋白包括抑制V-A型CRISPR/Cas系统和I-C型CRISPR/Cas系统的蛋白,如AcrVA1。

值得注意的是,当在人细胞中进行测试时,AcrVA1最为有效地抑制Cas12a的一系列直向同源物,包括MbCas12a、Mb3Cas12a、AsCas12a和LbCas12a。这项研究发现的这12个Acr基因提供了有用的对CRISPR基因编辑进行控制的生物技术工具。 (生物谷 Bioon.com)

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