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单细胞(single cell)取样问题多?单细胞分离技术讲解

来源:烈冰生物 2018-09-30 17:15

上次烈冰(NovelBio)带来的“单细胞测序困难重重——细胞消化悬浮方案”反响不错,受到了众多老师的关注和认可。今天烈冰就再次跟大家聊一些单细胞实验技术的具体操作问题,讲讲单细胞测序(Single-Cell Sequencing)中至关重要的一步——单细胞的分离。

    接下来,我们以NovelBio实验室在实战项目中做过的一些样品为例,按照不同组织/细胞类型进行实验技巧分享。 

肝脏


研究领域:肝癌、肝炎及消化性肝脏疾病,代表性物种为人、大/小鼠等。

肝脏可能是目前单细胞测序领域的一个重要分支,毕竟我国乙肝、丙肝及相应肝癌的患者数量确实太多了。无论是SCI文章还是中文核心期刊文章,大多数protocol都是很相似的,100-200 IU/ml的II型胶原酶,剪碎成小块(1-2 mm3),37℃水浴消化30 min-4 h。根据烈冰实验室实测的人肝癌和小鼠肝脏样品结果来看,肝组织都很大,20 min的消化时间,就能拿到足够多的单细胞了,毕竟细胞数量能够达到10的5次方级别即可(WHAT?不是说上机1万个细胞么?怎么需要提供10^5级别的细胞?莫急,我们最后会给解答)。也有一些课题组应用II+IV型胶原酶的混合液对肝脏组织进行两次灌注:i)第一次灌注,37℃预热的D-hanks`液,从门静脉进入冲洗肝组织内部的血液;ii)第二次灌注,II+IV型胶原酶,门静脉进入,通过流动的消化液逐步“侵蚀”肝脏内部血管内皮以及肝细胞之间的细胞连接,使组织块松散。后续使用组织剪和镊子进行物理撕裂分离,过70 um细胞筛。需要注意的是,整个灌注过程需要高压注射泵来保持恒定的速度,而且,本方法一般适用于动物原代肝细胞的分离,对于已经切除的肝癌组织,灌注法不太适用。

烈冰特此提醒:红细胞裂解液!红细胞裂解液!红细胞裂解液!请实验人员务必提前准备好新买的、质量好的红细胞裂解液!鉴于肝脏的解剖学和功能特性,其内部含有大量的血液;而红细胞对测序结果有一定影响,裂红这一部分必不可少。因此,要注意的是裂红试剂最好新买,根据离心后细胞团中红色细胞的含量/比例尽量一次处理完毕,不要裂红两次(细胞活性影响大),裂红时间能短就不要长(一般不超过5 min)。信了说明书的邪,37℃裂红5 min,操作2次,细胞活性下降很多。

脾脏


研究领域:免疫相关研究,代表性物种为大/小鼠。

脾脏作为最大的外周免疫器官,其内部含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,是进行病原感染及基础免疫学研究最常用的器官。操作方面满满的优点,无论是剪碎后IV型胶原酶的消化(仍然是100-200 IU/ml,37℃,20-30 min),还是直接暴力研磨,都能拿到很多很好的单细胞悬液。提醒一点,把脾脏离体后,立刻用铜网研磨,边研磨边加入完全RPMI-1640培养液(10% FBS),保证研磨过程中,单细胞会及时被培养液冲洗过铜网,而细胞团块以及一些成纤维细胞、血管内皮等不能通过铜网,铜网直径一般是50-70 um,请自行换算成目数。

肾脏


研究领域:内分泌、外周免疫损伤、肾炎等,代表性物种为人、大/小鼠病例模型。

由于肾脏外存在一层相对致密的膜,且解剖学结构很复杂(内部有皮质髓质肾盂肾盏,外部还有一些腺体),制备单细胞悬液的时候,务必要用手术剪或者刀片把组织切得很碎,这样后续消化得到的细胞中,对应各解剖结构的细胞类型才足够丰富。当然,烈冰也跟一些老师交流过,初步剪碎后,通过暴力研磨也可以拿到足够好的细胞,后续可以试试。烈冰实验室亲测的结果,IV型胶原酶常规消化流程,可以拿到10^7级别且活性相当高的单细胞悬液,很高效。

 

外周血来源的单细胞


研究领域:基础免疫学、免疫相关疾病、内分泌相关疾病等,代表物种为人或者转基因小鼠。

这部分实验,需要先区别2个名词:白细胞和外周血单个核细胞(PBMCs)。血液通过EDTA管子(不能用肝素管!!!)抗凝后,直接裂红处理,得到的细胞沉淀是白细胞;用淋巴细胞分离液得到的中间云雾层,是PBMCs。主要的差别在于白细胞包含嗜酸/嗜碱/中性粒等细胞,而PBMCs没有。

随后,我们可以开始实验了。无论是直接裂红,还是密度离心,拿到目的细胞群后,一般都是素质三连(离心---弃上清---洗液重悬),然后计数+计活性,最后混匀稀释到一定数量后上机铺板。整个流程是最简单易行的了。

延伸一些,如果老师们的研究目的细胞群体是某一个亚群的细胞,比如造血干细胞,势必会用几种颜色的直标抗体进行FACS分选。这里会衍生出2个实际会遇到的难题:i)目的细胞数量太少,达不到10^5级别;ii)FACS分选后,细胞活性也可能不太好。

针对i)数量少的问题,如果原始来源的细胞量足够,可以通过多批次磁珠富集的方法,收集足够多的细胞,比如肝脏内部的巨噬细胞(Kupffer细胞)在组织内含量很低,直接分离可能数量太少,建议通过磁珠富集的方法进行。又或者Treg细胞,正常状态下,仅占PMBSs总量的1%左右。乖乖用磁珠富集了pool在一起再做后续实验吧。而问题ii),就比较困扰。FACS分选,看似是机器自己操作,但不同的操作人员的操作习惯、实验手法、以及机器配置对细胞活性都有影响。实在无法避免这一步骤的话,请先做预实验,摸索稳定的分选条件。

另外, FACS分选时,标记抗体越多,拿到的细胞同质性越高,数量也越少;而问题是,单细胞测序,本身就是要测细胞群体的异质性。拿同质性很高的细胞来做异质性分析,理论上是可行的(万一里面确实有不同的细胞亚群呢,不就发达了么?!CNS不就随便发了么?!),只不过听起来怪怪的,而且数量不够这个问题,一定会影响后续实验。怎么办?烈冰建议,如果目的细胞群体在总细胞中的含量并不是很低的话,其实可以直接拿总细胞群体去做实验,通过后续的tSNE分析来进行亚群区分以及biomarker分析来确定每一群的marker gene。当然,如果目的细胞亚群数量很少,可能占比10%左右,直接RUN总细胞确实会造成低丰度细胞亚群的细节损失。怎么办?这时就需要灵活一点,少染几个染色的抗体,多pool几个样本做混池,间接提高目的细胞亚群在总细胞内的相对比例。(请注意,以上建议仅仅是为了实验能够顺利进行的一些折中方式,可能在后续分析中会有一定的影响,还没有最终的结论,请勿直接使用。)

最后解答一下前面预留的问题:

烈冰单细胞测序不是说上机1万个细胞么?怎么需要提供10^5级别的细胞?

提供的总细胞量与实际上机细胞量,是两个概念。老师提供了总细胞,需要经过几次buffer的素质三连(沉淀—弃上清—重悬),又有可能被裂红,还要过细胞筛去除细胞团块。这一系列操作,会丢失大量的细胞(实验手法的稳定性,在这一步就体现出来了,烈冰表示很有自信),而且这些丢失无论是用何种平台都是无法避免的。因此,如果最初老师提供的总细胞量低于10^5这个数量级,一系列操作后可能无法满足1万个细胞的上机要求。这时候就只有两个选择:i)直接上机,硬做;ii)通过sample label抗体和其他样品进行pool样混合上机,最后通过数据分析来区分(套路等同于NGS的样品间INDEX)。

 

好了,今天的单细胞分离实验技术分享就到这里,想要了解更多单细胞测序实验技巧和数据分析套路,请登录烈冰官网www.novelbio.com,在“博客”专区会有不断更新的技术干货与您分享!

 

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