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Nat Genet:挑战常规!揭示人细胞中的CRISPR-Cas9基因编辑竟通过范可尼贫血通路发生

来源:本站原创 2018-08-02 06:40

2018年8月2日/生物谷BIOON/---尽管对CRISPR-Cas9基因编辑抱有很高的期望和进行了很高的投资,但科学家们仍然需要了解它如何在人体中发挥作用。

在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员发现人们对Cas9酶切割DNA后细胞如何修复基因组作出的假设是错误的。这一发现有助深入了解为何CRISPR-Cas9基因编辑在几乎所有细胞中都能很好地发挥作用(尽管不会在所有细胞中都取得同样的成功)。它可能有助于人们提高细胞将新的DNA片段插入到基因组---比如利用正确的DNA序列替换有害的突变---中的效率和对CRISPR-Cas9基因编辑加以调整以便获得期望的结果。相关研究结果发表在2018年8月的Nature Genetics期刊上,论文标题为“CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway”。

图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。 

论文第一作者、加州大学伯克利分校博士后研究员Chris Richardson说,“如果你想要治疗镰状细胞性贫血,那么你取得成功的机会与你利用正确的基因替换发生突变的镰状细胞基因的效率密不可分。如果你从患者体内收集了一百万个细胞,并且你实现的DNA片段插入率为10%,那么这就不如30%到40%的DNA片段插入率那么好。能够操纵这些细胞来增加一个被称作同源介导修复(homology-directed repair, HDR)的过程的发生频率是非常振奋人心的。”

论文通信作者、加州大学伯克利分校分子与细胞生物学兼职教授Jacob Corn说,“基因编辑是非常强大的,人们对它充满着期待,但到迄今为止,它出现了很多错误。它在人体细胞中发挥作用的机制是未知的,而且人们对此提出了很多假设。我们终于开始了解它的作用机制。”

CRISPR依赖于DNA修复

CRISPR-Cas9是一种革命性的工具,这是因为它能够精确地靶向含有数十亿个碱基的人基因组中的特定DNA序列并切割双链DNA分子。但在那之后,细胞就开始修复这种损伤。

DNA修复能够通过两种方式进行。酶能够将悬挂的DNA末端连接在一起,这通常导致一个或多个碱基添加或缺失,从而破坏基因的功能。或者,其他的酶能够利用与切割位点的上游和下游序列相匹配的单链DNA修补这种断裂。一条互补的DNA链也会由此产生,从而完成这种双链DNA修复。

前者被称为非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ),它似乎是CRISPR切割后出现的最为常见的结果。后者就是前面所提及的同源介导修复(HDR),相比于其他的细胞,它在某些类型的细胞中更为频繁地发生,并且需要一种能够用于修补这种断裂的DNA片段的存在。科学家们经常提供单链DNA,并希望细胞利用它实现将新的DNA序列替换掉错误的DNA序列的目的。然而,这两个DNA修复过程都有点神秘,而且没有人知道为何有些细胞很容易修补DNA断裂,而其他细胞很少这样做。

Richardson说,“将CRISPR-Cas9用于医学或合成生物学应用的热情是非常高的,但是没有人真正地知道在将它导入到细胞中后会发生什么。它会导致双链DNA断裂,你依靠细胞来修复这些断裂。但是人们并没有真正地理解这个过程是如何发挥作用的。”

为了找出哪些DNA修复酶在CRISPR切割后的同源介导修复中发挥着至关重要的作用,Richardson和Corn采用了一种被称作CRISPR干扰(CRISPRi)的技术,一次一个地敲除已知或怀疑参与DNA修复的2000多个基因。

当许多经证实起着重要作用的基因被沉默时,同源介导修复发生的频率显著下降。令人吃惊的是,这些基因也参与一个之前认为并不参与CRISPR修复的重要修复通路。

范可尼贫血通路(Fanconi anemia pathway)

这个修复通路涉及21种不同的蛋白,它被称为范可尼贫血通路,这是因为如果编码这些蛋白的基因中的任何一个遭受破坏,那么人们就会患上范可尼贫血,这是一种罕见但严重的遗传性疾病,在这种疾病中,骨髓不能够产生足够的新的血细胞。它与出生缺陷和高的癌症风险(包括童年时患上白血病的几率为10%)有关。很少有范可尼贫血患者活到30岁以上。

这个通路已被人们所知和研究了数十年,但是人们普遍认为它修复一种特殊的DNA损伤:DNA链间交联(DNA interstrand crosslink):一条DNA链上的核苷酸与相邻DNA链上的核苷酸紧密地结合在一起,这会干扰DNA复制并经常杀死细胞。Corn指出,科学家们在20世纪80年代就报道了同源介导修复与范可尼贫血通路之间的关联性,但这一点被人们忽视或误解了。

Richardson说,“基于我们的研究,我们认为范可尼贫血通路在修复其他类型的DNA损伤中起着重要的作用,不过最好将它理解为一种修复双链DNA断裂的通路。在Cas9进行编辑后,如果你想插入新的DNA序列,那么范可尼贫血通路是必需的。”

然而,范可尼贫血通路在修复CRISPR断裂中的重要性让人对一些计划用于疾病治疗的CRISPR疗法本身提出质疑。在没有活性的范可尼贫血通路的情形下,在Cas9切割DNA后,细胞可能无法利用正常的基因替换发生突变的基因。

事实上,范可尼贫血通路的活性水平可能会影响CRISPR在特定细胞中插入DNA的效率。这些研究人员得出结论:尽管非同源末端连接是双链DNA断裂发生后的默认修复机制,但范可尼贫血通路与它竞争,并且更高的范可尼贫血通路活性导致更多的同源介导修复和更少的非同源末端连接发生。

癌症治疗

虽然这些发现有助于科学家们更好地理解人体细胞中的DNA修复机制,但是它们也可能有助于人们开发出靶向癌细胞中的DNA修复的抗癌疗法。鉴于如今其他的因素似乎也参与修复双链DNA断裂,因此这项研究扩大了当遭受异常调节时会干扰癌细胞中的DNA修复而让它们更容易死亡的蛋白清单。

Richardson还发现作为范可尼贫血通路中的一种蛋白,FANCD2始终靶向由CRISPR-Cas9产生的双链断裂位点,这表明它在调节将新的DNA序列在切割位点上插入到基因组中起重要作用。人们可能能够对FANCD2蛋白加以调整来提高细胞通过同源介导修复机制插入DNA的频率。 Richardson说,“此外,由于FANCD2定位到Cas9导致的断裂位点上,因此你能够利用FANCD2来绘制Cas9在任何细胞类型中进行切割的位置。如果你对一群细胞进行编辑,而且你想要知道在靶切割(on-target cut)和脱靶切割(off-target cut)的位置,那么你能够仅绘制FANCD2结合到基因组中的位置,这样就能够找到切割位置。”

Corn说,“整个范可尼贫血通路影响非同源末端连接和同源介导修复之间的平衡;它起着类似于交通警察的作用。因此,患者的基因型将影响你如何进行基因编辑。”(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Chris D. Richardson, Katelynn R. Kazane, Sharon J. Feng et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway. Nature Genetics, August 2018, 50(8):1132–1139, doi:10.1038/s41588-018-0174-0.

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