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轻松解锁外泌体RNA生物标志物的研究策略

来源:锐博生物 2018-07-17 09:46


小编推荐会议:2018外泌体技术与应用论坛

 

 

在当下这种高负荷的科研工作环境下,或许您需要的是一剂轻松又不失严谨的良药,近年来外泌体(exosome)越来越受到医学研究人员的重视,被认为是疾病标志物早期诊断或监测的潜在新途径,对于循环外泌体RNA(尤其是miRNA),已经成为检测早期癌症的最具前景的生物标志物之一,而lncRNA作为当下的另一个研究热点,尚不确定血浆中肿瘤细胞来源的外泌体lncRNA是否能有效诊断早期癌症。

今天小编要为您分享来自厦门大学中山医院院长蔡建春教授课题组等最近发表于《Mol Cancer》的一篇有关胃癌患者循环外泌体lncRNAs(lncUEGC1)对早期胃癌(EGC)诊断价值的文章,介绍一下外泌体lncRNA生物标志物鉴定的核心策略。

先来了解外泌体lncRNA研究路线

为什么要研究早期胃癌中外泌体的lncRNA?

胃癌(GC)在癌症相关死亡的人数中排名第二,它是包括亚洲范围包括中国在内的最致命的一类癌症。那么导致胃癌发生的因素有哪些呢?目前,除了遗传因素和环境因素外,在当今这个繁忙又快节奏的社会环境下,不良的饮食习惯以及繁重的工作压力等均与胃癌的发生息息相关,甚至使得胃癌呈现年轻化倾向。绝大多数胃癌属于腺癌,早期无明显症状,常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似,易被忽略,我国当下胃癌的早期诊断率仍较低,提高胃癌的早期诊断和治疗生存率是科学家研究的一个出发点。那么关于胃癌的早期诊断的方法有什么新的研究进展吗?研究者们将目光聚焦到了外泌体中的lncRNA,因为尚不确定血浆中肿瘤细胞来源的外泌体lncRNA是否能有效诊断早期癌症,同时有望提高早期诊断的敏感性和特异性。

基于外泌体RNA测序结果筛选并鉴定EGC特异性外泌体RNA

在该研究中,采用逐步离心、超速离心法等途径制备外泌体,分离了来自5个健康个体、10个I期GC患者的血浆以及来自4个人原代胃上皮细胞(HPSEC)和4个胃癌细胞(GCC)的培养基的外泌体。经纯化的外泌体RNA通过RNA-seq进行表达谱分析,以鉴定EGC特异性外泌体lncRNA。基于RNA测序数据分析,发现6个基因在两组中均显着上调,专注于其中2个具有最高的上调倍数变化和表达水平的EGC特异性外泌体lncRNAs,并将它们命名为lncUEGC1和lncUEGC2。

基于RNA测序结果筛选出EGC特异性外泌体lncRNA

qRT-PCR验证测序数据的准确性

采用qRT-PCR的方法进一步验证这两个外泌体lncRNAs在I期、II期 GC患者以及健康个体的表达情况,同时也验证了在GCC和HPSEC中的表达。总体来看,这些结果与RNA-seq数据一致,表明lncUEGC1和lncUEGC2可能具有作为EGC特异性外泌体lncRNA标志物的潜力,用于早期非侵入性GC诊断

外泌体lncUEGC1和lncUEGC2在EGC样本和GCC中的表达模式

循环lncUEGC1和lncUEGC2在EGC样本中的稳定性测试

考虑到血浆中循环RNA可能具有较差的稳定性而影响诊断结果,为了检测lncUEGC1和lncUEGC2在血浆中的稳定性,用RNase直接处理20个I期GC样本的血浆样品。在用或不用RNase处理的血浆之间,总循环lncUEGC1的相对血浆浓度没有显着差异(P = 0.4154)。然而,在RNase处理下血浆总LnCuEGC2的相对血浆浓度下降约2倍(P=0.0305)。还评估了超速离心后外泌体耗尽的血浆中的lncUEGC1和lncUEGC2水平。相对于外泌体耗尽的血浆,lncUEGC1在外泌体中的表达水平丰富,但是lncUEGC2的表达没有显着差异,揭示了一部分lncUEGC2未被包裹在外泌体内。此外,针对I期GC患者该项研究又分析了在血浆外泌体RNA和血浆总循环RNA中相对lncUEGC1和lncUEGC2表达水平的相关性。根据计算的相关系数,在血浆外泌体RNA和血浆总循环RNA中相对lncUEGC1和lncUEGC2的表达水平呈正相关关系。可以判断几乎所有的血浆lncUEGC1被包裹在外泌体中,从而防止被RNase降解,具有较理想的稳定性。

外泌体lncUEGC1和lncUEGC2在EGC样本和GCC中的稳定性检测

CEA、lncUEGC1和lncUEGC2在验证集合中的表达模式和诊断准确性

为了确定外泌体lncUEGC1和lncUEGC2以及常规肿瘤标志物CEA对EGC检测的诊断能力,该研究检测了血浆外泌体lncUEGC1和lncUEGC2表达水平以及血清CEA水平,以区分EGC患者、癌前CAG病变患者和健康对照者。建立受试者工作特征曲线(ROC曲线)以评估诊断的准确性,由于目前使用的液体活检指标难以区分早期胃癌和癌前病变,该项研究进一步建立了血浆外泌体lncUEGC1和lncUEGC2以及血清CEA的ROC曲线来区分CAG患者(n = 18)和I期GC患者(n = 23),该指标可以有效地区分EGC和癌前病变。研究表明,外泌体lncUEGC1可能有望用于EGC诊断的高灵敏度,稳定性和非侵入性生物标志物而被开发。

CEA,lncUEGC1和lncUEGC2在验证集中的表达模式和诊断

此项研究首次使用外泌体lncRNA测序系统彻底筛选潜在的EGC生物标记物。同时这项研究也揭示了外泌体的独特性质,包括它们嵌入癌症来源的RNA的能力、在循环过程中的稳定性以及可重复检测性。

针对外泌体RNA生物标志物的研究挑战,锐博生物提供从样品制备、测序到功能研究的整体解决方案,涵盖了从外泌体抽提与鉴定(Ribo? Exosome Isolation Reagent、粒径检测、表征蛋白流式检测)、外泌体功能验证(EdU-EU细胞检测试剂盒)、外泌体miRNA/lncRNA测序到外泌体功能分子验证(FISH试剂盒、ChIRP Probe、RNAi体外体内产品、RBP siRNA library)以及外泌体与功能分子的动物实验(裸鼠移植瘤模型构建、动物活体成像)的整体产品与服务,为帮助您解决在研究或实验中遇到的挑战提供服务。

关于外泌体(Exosomes)

外泌体来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的囊泡,是由活细胞分泌而来,是一类大小介于30-200nm的含有DNA、RNA、蛋白质和脂类的微囊,几乎所有类型的细胞都能分泌,广泛存在于血清、血浆 、尿液等各种体液中。Exosomes 参与调控重要的细胞生理活动,在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结过程中的作用均有报道,成为多种疾病治疗的潜在靶点、早期诊断标记物、靶向药物载体等,成为近年来生命科学及医学领域的研究热点。(生物谷Bioon.com)

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