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吐血整理外泌体标记方法(附原文)

来源:翊圣生物 2018-07-12 12:26


小编推荐会议:2018外泌体技术与应用论坛

 

 

Exosome(外泌体)是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构;参与细胞之间的交流,物质的运输以及正常生理过程的维持,此外还与疾病的产生有关。

对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪,有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种,包括亲脂性的染料和膜渗透型的化合物等。

下面小编就为大家罗列下近几年文献发表中有关外泌体染色的方法。

1

亲脂性染料:

PKH-67(green)/PKH-26(red)

染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光,主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67,PKH-26具有更长的半衰期,标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

将PKH67标记的神经细胞外泌体与b.End3 细胞共培养后的荧光图(图片引自:Xu B, Zhang Y, Du X-F, et al. Neurons secrete miR-132-containing exosomes to regulate brain vascular integrity. Cell Research. 2017;27(7):882-897.

2

亲脂性羰花青染料

(carbocyanine dyes):DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列亲脂性的荧光染料,可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱,当与细胞膜结合后其荧光强度大大增强。且具有消光系数高、极性依赖性、激发态寿命短等特点。一旦进入细胞膜后,可在整个细胞膜上扩散,最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。

下面小编整理了使用这类染料对外泌体进行标记的文献。

DiI

将DiI标记的外泌体注射入小鼠海马齿状回(DG)区,分别观察第3、6和20天的荧光结果,对比可以发现外泌体在皮质层发生了很大的迁移。(图片引自:Zheng T, Pu J, Chen Y, et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around β-Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017;9:12.)

DiD

DiR

体内静脉注射DiR标记的外泌体,24H后进行成像观察,结果如上图所示。(图片引自:Wiklander OP, Nordin JZ, O'Loughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.)

DiO

使用ExoChip-chambers捕获不同样品中的exosome,然后使用DiO进行外泌体染色,通过观察荧光的强弱对不同来源样品中的外泌体进行定量分析。(图片引自:Kanwar SS, Dunlay CJ, Simeone DM, Nagrath S. Microfluidic device (ExoChip) for On-Chip isolation, quantification and characterization of circulating exosomes. Lab on a chip. 2014;14(11):1891-1900. )

3

渗透型的化合物标记法:

CFSE/CFDA/Calcein-AM

CFSE

羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(英文 ,CFSE),可被动扩散进入细胞。 试剂本不具荧光,直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团,产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。 琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应,形成稳定且能用醛类固定的荧光偶联物。

使用CFSE进行标记的外泌体可以用于后续FACS、NTA和显微镜观察使用。(图片引自:van der Vlist EJ1, Nolte-'t Hoen EN, Stoorvogel W, et.al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry,Nat Protoc.2012 Jun 14;7(7):1311-26.Nat Protoc)

Calcein-AM

在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成具有膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。

4

利用外泌体表面的巯基(thiol group)

对外泌体进行标记:

5

通过物理的方法对外泌体进行标记:

放射性标记物:99mTc-HMPAO

量子点微囊泡标记:Ag2Se @锰量子点

Ag2Se @锰量子点一体化具有优良的近红外(NIR)荧光和磁共振(MR)成像能力,可用于MV体内的高分辨率双模式实时有效的标记跟踪。是一种低毒、高灵敏、非侵入性的实时活体成像的方法。

Ag2Se @锰量子点是通过控制Mn+与Ag2Se纳米晶体在80℃的NaOH溶液反应制成,其具有约1.8纳米的超小尺寸,良好的水分散性,高NIR荧光量子产率和12.87毫-1-1高纵向弛豫。超小尺寸使他们能够通过电穿孔直接和有效地装入的MV。该方法可以用于不同来源的微囊泡标记,对微囊泡的不会有太多损伤。(生物谷Bioon.com)

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