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微流控技术在心肌标志物检测中的应用

来源:微流控之家 2018-06-21 12:58


小编推荐会议:2018(第二届)微流控技术前沿研讨会 

 

自50年代以来,动态测定一些代谢酶活性,如乳酸脱氢酶和谷草转氨酶等,一直是诊断AMI(Acute Myocardial Infarction,急性心肌梗死)的金标准。但由于这些代谢酶在人体的其他器官和肌肉中也大量存在,除 AMI外,运动、炎症也可引起乳酸脱氢酶和谷草转氨酶等的升高,所以对他们的检测不具有提示患有AMI的特异性。近几年来,一些新的具有高度特异性和敏感性的心肌标志物检测指标被普遍用于临床实验室诊断,如心肌肌钙蛋白T(cTnT)或心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白 (Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、B型尿钠肽(BNP)和超敏C 反应蛋白(CRP)等。正确应用这些新的心肌标志物,为临床准确诊断、鉴别诊断和判断治疗效果起到了革命性的作用。微流控芯片技术作为近年来发展迅速,集生物、化学、医学、流体、电子、材料和机械等于一体的崭新研究领域,具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度快和高通量测试等特点,可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析,并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程,是进行心肌标志物检测的理想平台。

微流控芯片光学方法检测心肌标志物

目前对于心肌标志物的检测,大多是基于抗原抗体的免疫反应。生物学家通常利用荧光物质 标记抗原或抗体或酶标抗体,然后从反应生成物的荧光强度、反应底物比色和捕获化学发光底物微光来定量被检测物的浓度。底物可见光比色法因灵敏度相对较低,一般无法满足低浓度心肌标志物的检测需求,应用较少。而荧光免疫方法因具高灵敏度而被多数研究者采纳。

对于微流控芯片微米级的检测通道,荧光免疫方法有时并不能满足低浓度心肌标志物的检测要求。为此,有团队创造性地设计了浓缩荧光标记物的反应池和嵌入式光电倍增管检测装置,实现了对C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)的低浓度检测。其具体实验过程如下:首先制作了带1mm×0.8mm×30um预浓缩反应池的T型聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)芯片,在反应池中设计物理微结构富集CRP抗体包被的磁珠;然后将荧光标记的CRP抗原和待检测CRP抗原注入反应池,孵育后洗脱荧光标记;最后在反应池下游微通道利用嵌入式光电倍增管检测荧光信号,结果测得CRP最低检测限为1.4 nmol/L。该方法有效地提高了检测的灵敏度,但缺点在于磁珠修饰抗体和荧光标记抗原等操作都必须在芯片外进行,检测时间相对较长。

微流控技术在心肌标志物检测中的应用

利用微流控芯片平台分析生物标志物时,常需各种进样泵和驱动泵等,使平台极其复杂。有团队利用空气在PDMS中溶解度高和扩散速度快的特性,研制了无动力注射的免疫分析芯片。该芯片具有结构简单、使用方便等优点。在实验过程中,他们对竞争法和夹心法非均相免疫分析都进行了研究,操作如下:通过先将抗体修饰于内壁,再利用荧光法检测兔IgG和人CRP。最终结果显示:样品消耗为1μL,免疫分析时间为 20 min,检测限分别为 0.21 nmol/L和0.42 nmol/L。以上表明该方法具有样本消耗少、分析时间短和检测灵敏度较高等优势。

微球免疫分析通常能增大抗原抗体的结合面积,缩短抗原抗体所需要的反应时间,提高检测 灵敏度。有团队在硅片上加工出微室阵列,将共价键合抗体的琼脂凝胶微珠装入微室中,通过毛细管引入各种反应试剂,然后利用荧光或可见光比色检测唾液中 CRP,最终 12 min 完成检测,最低检测限达5 fg/mL,而在10 fg/mL~10 pg/mL间有较好的线性相关性,检测灵敏度优于商品化超敏CRP ELISA检测试剂盒。这种微球分析与微流控结构相结合的系统,灵活减小了分析设备体积,实现了唾液中微量CRP的超灵敏检测。

芯片表面的亲疏水性直接影响芯片的检测效果。表面改性一直是微流控芯片的重点研究领域。国外团队对环烯共聚物(Cycloolefin Copolymer,COP)芯片表面性质进行改性:分别用氧等离子体氧化、3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)硅烷化和右旋糖酐修饰来增加其表面亲水性,进而易于捕获抗体结合。该改性手段稳定可靠,结合免疫检测方法,实现了对血液中CRP的低浓度检测,最低检测限达 2.6 ng/mL。

利用微流控芯片平台高通量分析心肌及其他生物标志物,可以节约检测成本和时间,是未来的发展趋势。国外研究机构结合非竞争免疫分析、裂解标记免疫分析(Cleavable Tag Immunoassay, CTI)和胶束电动色谱(Micellar Electrokinetic Chromatography,MEKC),同时分析了AMI的CK-MB、cTnT、cTnI和Myo四种心肌标志物。通过对以上四种心肌标志物抗体进行不同荧光物质标记,使反应后被切割的荧光标签在芯 片MEKC中层析分离,而每种荧光标记在芯片MEKC 中有不同的迁移率,通过定量不同荧光 标签量来定量各组分标志物浓度。利用该平台对CK-MB、cTnT、cTnI和Myo的检测限分别为 3 ng/mL、25 pg/mL、2 ng/mL和5 ng/mL。该研究的局限在于CTI 和 MECK分开进行,未能整合在一块芯片上实现。故该研究组还在研究芯片在线CTI,将芯片在线CTI与芯片MEKC结合,真正实现微流控芯片的高通量分析,促进即时诊断产业的发展。

微流控芯片电化学方法检测心肌

与光学检测方法相比,电化学方法具有灵敏度高、反应快、电极微型化、对芯片材质没有特殊要求等特点。电化学方法已慢慢成为当今微流控平台的主要检测手段。

随着微电极加工技术的发展,研究者经常采用一些特殊技术结合电化学检测方法来达到痕量 检测。如利用自组装单层膜技术结合电化学检测方法,检测Myo和血红蛋白。该研究中工作电极是1 cm×2 cm的金修饰硅片,其表面修饰有自组装单层膜,当待测样本结合到膜上时,工作电极与参比电极间电位发生改变,通过检测电势变化而测定样本中蛋白浓度。将此技术与微流控芯片相结合,减少待测样本体积和检测时间,增加反应灵敏度,是理想的即时诊断平台。

微流控技术在心肌标志物检测中的应用

利用量子点标记抗体结合方波溶出伏安法(Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry)同时检测两种心肌标志物cTnI和CRP。通过SWASV与微流控平台结合,利用微通道电泳浓缩并输送金属离子。当cTnI和CRP分别在0.01~50μg/L和0.5~200μg/L范围内时,检测电流与检测物浓度具有较好的线性一致性。该方法检测cTnI和CRP的最低检测限分别为0.004μg/L 和0.22μg/L。通过极谱电流时间曲线法监测电子转移,实现了对 cTnT 的超灵敏检测。作者加工了具有多个电极的COP微流控芯片,该芯片含一个捕获磁珠带、两个参比电极和一个工作电极,可同时独立检测六个样本。作者用该系统检测了溶解在PBS中的cTnT和真实血样中的cTnT 含量,最低检测限分别达0.017 ng/mL 和0.02 ng/mL,灵敏度大大超过传统手段。

另外,离心微流控磁盘因其自动化、可一次性使用、不用注射泵、没有复杂的流体相互联系、仅靠离心力驱动样本等特点,在微流控芯片领域广受欢迎。

其他微流控芯片检测心肌标志物

随着传感器技术的迅速发展,越来越多的检测手段被用在对心肌标志物的检测。如设计与玻片键合的T型PDMS芯片,同时在玻片上加工两块镀金薄膜A和B。样本中的BNP通过 EDC/NHS系统先与薄膜A结合,之后加入乙酰胆碱酯酶修饰的抗BNP抗体,然后再加入硫代乙酰胆碱,硫代乙酰胆碱在乙酰胆酯酶的催化下变成硫代胆碱并流动至薄膜B上聚集。而薄膜B处有表面等离子体共振(SPR)检测装置,硫代胆碱在薄膜B处的聚集可引起SPR角度改变。之后根据硫代胆碱的浓度与上游加入薄膜A上的BNP 浓度成反比,进而可通过SPR 角度改变来测定BNP浓度。结果表明该系统检测BNP时,在5 pg/mL~100 ng/ml具有较好的灵敏度,检测时间仅为 30 min。

有团队采用光子晶体内全反射系统(PC- TIR),设计一个独特的敞开光学微腔,以便功能化微腔表面,使抗原抗体更好地结合。作者用四氢呋喃、APTES、羧甲基右旋糖酐等处理传感器 表面并固定Myo 抗体在其上,利用PDMS加工的微通道输送待测样本和对照液体PBS到传感器部位。当待测样本中目标抗原Myo与传感器表面抗体结合后,共振波长反射泡发生漂移,波长的偏移值与待检测的Myo浓度成正比。该法检测限达70 ng/mL,在70~1000 ng/mL 范围内有较好的线性一致性。

光学法检测心肌标志物主要包括荧光和化学发光两种方法。荧光法需要外加光源激发分子产 生能级跃迁,进而发光。由于生物样品中的蛋白质、氨基酸等分子也会产生背景荧光,故需选择合适的荧光试剂和样品处理方法,减少非特异性吸附蛋白的影响,降低背景干扰。而化学发光是自身发光,无需外加光源,背景干扰小,灵敏度更高,但需暗室及进行冷发光检测,其检测器体积相对较大。电化学分析法可分为电导分析法、电位分析法、伏安法、极谱分析法、电解和库仑分析法等。这些方法分析灵敏度和准确度较高、测量范围宽、仪器设备简单、价格低廉,运用于微流控芯片检测平台时,对芯片材质没有特殊要求,并可以将电极微型化以减小平台体积。与光学法相比,电化学法在心肌标志物检测方面具有更广阔的应用前景。

微流控芯片作为一门新兴学科,可以集进样、预处理、分离和检测于一体,具有样品需求量小、便携、分析快速等特点,是理想的心肌标志物检测平台。研究和发展适应于心肌标志物即时诊断的微流控芯片产品,符合检验医学自动化和简单化的发展趋势,适应当今社会高效、快节奏的工作方式,满足心血管疾病患者在时间上快速检测的要求,可使患者尽早得到诊断治疗。(生物谷Bioon.com)




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