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重磅!4篇Science论文聚焦基于CRISPR的下一代诊断工具

来源:本站原创 2018-04-30 07:27

2018年4月30日/生物谷BIOON/---2017年,美国布罗德研究所核心成员张锋(Feng Zhang, 音译)教授及其团队开发出一种被称作SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)的诊断平台。它利用一种依赖体热的扩增过程来提高临床样品中的DNA或RNA水平。一旦这种水平增加,他们利用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA,从而使得这种靶向RNA 的CRISPR工具的灵敏度增加了一百万倍,而且这种工具能够在几乎任何环境下使用。

这种诊断平台的关键在于Cas13酶和RNA报告分子。Cas13经编程后结合到一段特定的RNA片段上。当Cas13a检测到靶RNA序列时,它的无区分的RNA酶活性(即附带切割活性)也会切割这种RNA报告分子,从而释放可检测到的荧光信号。
图片来自Zhang lab, Broad Institute。

到目前为止,SHERLOCK的一个关键的初步步骤涉及从患者样品中提取和分离核酸,这通常需要实验室和经过培训的人员,这使得很难在现场完成诊断

为此,在第一项新的研究中,布罗德研究所成员Pardis Sabeti教授、Sabeti实验室的研究生Catherine Freije和博士后研究员Cameron Myhrvold开发出一种更加简单的方法,从而允许Cas13直接在唾液或血液等体液样品中检测它的靶标。相关研究结果发表在2018年4月27日的Science期刊上,论文标题为“Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13”。

这种方法被称作HUDSON(Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases, 即对未提取的诊断样品进行加热来消除核酸酶)。它由对临床样品进行快速的化学和热处理以便灭活某些会降解基因靶标的酶。这些经过处理的临床样品随后通过SHERLOCK诊断平台进行检测,最终的检测结果(阳性或阴性)能够在试纸条上很容易地观察到。这一整套检测流水线能够在两个小时内完成。

通过将HUDSON和SHERLOCK联合使用,Sabeti团队能够直接在患者的唾液和血清样品中检测到登革热病毒。这种平台还能够检测之前添加到健康血液和尿液样品中的寨卡病毒颗粒。

此外,Sabeti团队对用于SHERLOCK诊断平台的试剂进行设计,从而使得能够更容易地更快地将多个相关的病毒(寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒)彼此之间区分开来。当患者出现一种能够由有多种病毒引发的一般症状(如发热)时,这些改进是特别有用的。

Sabeti团队进一步证实了SHERLOCK对仅在单个核苷酸上发生的突变---比如,这种突变能够导致耐药性或对更大的病毒传染性---的极其敏感性。在当前的这项研究中,这些研究人员设计出能够检测与小头畸形相关的寨卡病毒突变的测试方法。

Myhrvold回忆道,“在文献中描述了这种特定突变大约一周后,我们对它进行诊断和测试,并且我们能够在近期的寨卡疫情期间收集的患者样品中检测到它。 “这才是真正的理想:不仅能够揭示人们感染哪种病毒,而且还能够揭示这种特定病毒毒株的特征以及它可能来自何处。”

在第二项新的研究中,布罗德研究所核心成员Feng Zhang 教授和他的团队对SHERLOCK诊断平台进行一系列优化,开发出一种微型试纸条测试方法,在将试纸条浸入经过处理的样品中后,就会出现一条线来指示靶分子是否被检测到,从而允许用肉眼观察到测试结果,而无需使用昂贵的设备。相关研究结果发表在2018年4月27日的Science期刊上,论文标题为“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”。

他们让这种平台使用来自不同细菌种类的Cas13和Cas12a(以前称为Cpf1)酶来产生额外的信号。此外,他们还添加了一种额外的CRISPR相关酶(即Csm6)来放大检测信号,从而增加了SHERLOCK的灵敏度,并增加准确地定量确定样品中的靶分子水平和一次测试多种靶分子的能力。

在第三项新的研究中,加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授和她的团队通过将CRISPR的功能与分子信号枪相结合,开发出一种简单的方法。这种被称作DETECTR(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)的新方法能够实现灵敏而又准确的DNA检测。相关研究结果发表在2018年4月27日的Science期刊上,论文标题为“CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity”。

Doudna团队观察到在某些情况下,Cas12a会变成一种DNA切碎机,将附近的任何单链DNA进行切割。但这不是滥杀滥伤。为了开始砍刀行动,Cas12a首先必须找到一个精确的DNA靶标。人们能够通过添加一个告诉Cas12a寻找什么的向导RNA分子来对这个靶标进行编程。

一旦Cas12a锁定它的靶标并进行切割,它就会开始撕碎它能够发现的所有单链DNA。但是为了让这种系统变得有用,Doudna和她的同事们需要一种方法来观察Cas12a何时开始这种分子残杀,从而指示它已找到它的靶标。因此,这些研究人员使用了一种发光分子(一种易于发现的荧光分子),并且这种发光分子通过一种单链DNA与一种阻止这种发光分子发光的抑制分子连接在一起。当Cas12a开始砍刀行动时,它切割将这种发光分子和这种抑制分子连接在一起的单链DNA。这就移除了这种抑制分子,让这种发光分子发光---一种研究人员能够检测到的信号。

Doudna团队随后利用他们的DNA侦探进行测试。通过与加州大学旧金山分校的Joel Palefsky博士及其团队合作,他们寻找来自两种致癌性HPV---HPV16和HPV18---的DNA信号。这些研究人员获得了25份来自未感染上HPV、感染这两种致癌性HPV中的一种和同时感染上这两种致癌性HPV的人的DNA样品。对HPV16而言,DETECTR对这所有的25份样本都作出了正确的判断。对HPV18而言,DETECTR正确地判断了这25份样品中的23份。Doudna说,它错过的样品信号比较弱,可能能够通过设计不同的向导RNA加以改进。

针对这三项新的研究中,美国国家过敏症与传染病研究所的Daniel S. Chertow在同期Science期刊上发表了一篇标题为“Next-generation diagnostics with CRISPR”的评论类型论文。(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Cameron Myhrvold1,2,*,†, Catherine A. Freije1,2,3,*,†, Jonathan S. Gootenberg et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):444-448, doi:10.1126/science.aas8836

Jonathan S. Gootenberg1,2,3,4,5,*, Omar O. Abudayyeh1,2,3,4,6,*, Max J. Kellner et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):439-444, doi:10.1126/science.aaq0179

Janice S. Chen1,*, Enbo Ma1,*, Lucas B. Harrington et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):436-439, doi:10.1126/science.aar6245

Daniel S. Chertow. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):381-382, doi:10.1126/science.aat4982


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