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PNAS:利用CRISPR/Cas9开发出一种精准的基因组突变预防系统

来源:本站原创 2018-04-03 21:47

2018年4月3日/生物谷BIOON/---通用的DNA遗传编码中的单个碱基变化可导致或恶化许多危及生命的疾病。这种“点突变”能够将人体内的细胞转变为癌细胞,随后这种癌细胞继续生长而形成肿瘤,或者它们能够将将抗生素敏感性细菌转化为导致不可治愈的感染的抗生素耐药性细菌。在理想的世界中,临床医生应能够在携带着这样的有害点突变的细胞产生后立即将它们清除,从而更加有效地抵抗疾病。

如今,在一项新的研究中,来自美国哈佛医学院怀斯生物启发工程研究所(Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering)的研究人员报道通过将CRISPR/Cas9基因组工程系统转化为一种基因组监测工具,他们已完成实现这个目标的第一步。在怀斯生物启发工程研究所核心成员George Church和James Collins的领导下,这些研究人员开发出一种体内突变预防方法,这种方法能够允许切割DNA的Cas9酶区分相差单个碱基的基因组靶位点,并且仅切割不想要的靶位点。针对体外培养的或在小鼠胃肠道内定植的大肠杆菌菌株开展的概念验证研究中,这种方法能够阻止抗生素耐药性细菌变体存活。相关研究结果近期发表在PNAS期刊上,论文标题为“Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention”。
图片来自iStock/Meletios Verras。

向导RNA(gRNA)通过碱基互补配对将Cas9酶引导到它的基因组靶序列上。一旦到达感兴趣的位点上,Cas9就像一把分子剪刀,在指定的位点上切割靶序列。如果加以修复的话,那么这种故意引入的DNA损伤允许生物学家们编辑细胞的基因组,但是如果不加以修复,它将导致细胞死亡。然而,鉴于CRISPR/Cas9系统在许多有机体的基因组中寻找和切割靶序列的效率,让Cas9在次级位点而不是在完全相同的位点上随机切割的非特异性仍然给基因组工程师带来问题。这也意味着Cas9通常不能够充分地区分携带不想要的点突变的靶序列和它们的正常靶序列,也就不能够选择性地加以清除。即便是设计出的特异性更好的定制Cas9酶迄今为止也不能完全解决这个问题。

Church说,“通过着重关注gRNA的特征,我们的方法将Cas9的特异性显著提高到能够清楚地区分单核苷酸多态性并且能够清除不想要的基因变体的水平。我们的方法为在未来预防疾病开辟了一条全新的途径。”

之前的研究已表明gRNA与它的靶序列之间存在的某些不匹配不会影响Cas9切割DNA中的特定位点的能力。论文共同第一作者Alejandro Chavez 博士说,“我们猜测对一对给定的仅相差一个碱基的靶位点而言,在gRNA中鉴定出的一组错配将会消除Cas9对正常的靶序列的切割活性,但会维持着对携带有害点突变的靶序列的较强活性。这将在携带着点突变的细胞产生后阻止它正常运转。”

为了开发这种方法,这些研究人员利用了致病菌的酶中已知的导致它们对抗生素产生耐药性的点突变。通过关注其中的几种点突变并筛选具有不同错配组合的gRNA变体,他们能够鉴定出促使Cas9特异性靶向发生突变的基因序列但不靶向正常基因序列的gRNA。

论文共同第一作者Benjamin Pruitt说,“这种突变预防系统不仅在标准实验室条件下培养的大肠杆菌菌株中维持抗生素敏感性,而且在用于定殖于无菌小鼠胃肠道的细菌中也维持抗生素敏感性。这些持续多天的小鼠实验涉及持续地让这些小鼠服用一定剂量的抗生素,并证实即使在遭受潜在重大的环境压力时,这种系统仍然是非常有效的。”

这些研究人员认为,他们的突变预防系统除了有潜力用于未来的疾病预防之外,还可能马上协助生物技术行业阻止大规模培养的细菌发生导致它们没有生产效率或易被污染的突变,并研究微生物进化。”(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

Alejandro Chavez, Benjamin W. Pruitt, Marcelle Tuttle et al. Precise Cas9 targeting enables genomic mutation prevention. PNAS, Available online 19 March 2018, doi:10.1073/pnas.1718148115

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