基因治疗

是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的。即将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中,使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说,基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

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细胞治疗与基因治疗---载体纯化

来源:生物制品圈 2018-02-28 09:39

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细胞治疗是将细胞转移到一个病人身上,其目的是改善或治疗疾病。细胞治疗策略包括分离和转移特定的干细胞群,执行效应细胞,诱导成熟细胞成为多能性细胞,以及成熟细胞的重新编程。

基因治疗是一种新的治疗手段,是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的。即将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中,使用外源基因制造的产物来治疗疾病。从广义说,基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。

第一个基因疗法获准正式上市。这种CAR-T细胞疗法被批准授予诺华制药以商品名Kymiah用于临床,治疗25岁以下青少年儿童复发性或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)。FDA在官网称,这次批准是一次历史性行动,将为癌症和其他致命性严重疾病开创全新疗法。

2013年欧洲Glybera是用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。

通过一种腺相关病毒(AAV),将产生功能性脂蛋白脂肪酶的基因递送到患者骨骼肌,患者接受治疗后胰腺炎发病率大大降低,并可以放松饮食限制,提高生活质量。2003年,中国赛百诺公司生产的重组腺病毒P-53 (Gendicine) 成功获得了国家食品药品监督管理局SFDA 的生产批文,用于治疗头颈部肿瘤的基因疗法药物。

细胞及基因治疗用基因载体的分离纯化策略:

1.细胞及基因治疗载体,一般使用病毒或者超螺旋质粒为载体。载体颗较大,几十至上百纳米。在细胞和基因治疗中使用的较多的载体有:腺病毒(AdV),逆转录病毒(Rv),腺相关病毒(AAV),质粒,慢病毒(LV)等。

2.基因载体颗粒一般加大,所以纯化时载量偏低

3.一般基因载体颗粒带有负电荷。

4.病毒颗粒一般为蛋白衣壳和核酸组成,所以对于剪切力比价敏感。

细胞治疗与基因治疗常用载体特性

基因载体分离纯化工艺:

病毒类载体具有类似的结构表达和扩增系统所以病毒类载体可以使用通用的平台工艺:

腺病毒载体:

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70~90 nm的颗粒,由252个壳粒呈廿面体排列构成。

用于治疗的腺病毒在纯度、活性以及病毒制品中热源、支原体、杂蛋白、牛血清、Benzonase 的残留都有严格的指标。这就要求在设计生产工艺时,需要选用特异性好,高效的方法分离纯化腺病毒载体。层析方法纯化腺病毒已成为规模生产的首选方法。以往层析纯化腺病毒的方法有很多,如:利用金属螯和(IMAC Bestarose FF )+凝胶过滤(S-500 HR、 4FF)、离子交换层析(Q Bestarose XL ) 以及反相层析的方法 等纯化方法。 中试或生产规模的腺病毒纯化使用QXL阴离子交换,和Bestarose 4 FF分子筛组份分离。

病毒类载体的通用平台工艺

病毒类载体的通用平台工艺:

腺病毒纯化工艺:

第一步:细胞分离:腺病毒培养过程中部分腺病毒分泌到培养基中,部分在细胞中。使用离心或中空纤维将培养基上清和细胞分离,细胞采用冻融的方法裂解或去污剂Triton X-100(浓度通常1%)。加入Benzonase 酶切断染色体DNA,降低样品粘度。

第二步:澄清,使用中空纤维或离心去除细胞碎片。

第三步:浓缩更换缓冲液,将培养上清(如果上清中的病毒颗粒较多,舍弃影响收率)与澄清后的样品混合,使用中空纤维浓缩,更换为离子交换的缓冲液。使用Q Bestarose XL其缓冲液为50mM TrisHcl ,5% glycerol ,pH 8.0。

第三步:阴离子交换纯化, 使用 Q Bestarose XL ,采用Nacl 洗脱,通常腺病毒在0.4-0.6M Nacl浓度时被洗脱。洗脱后腺病毒在高盐缓冲液中。

第四步:分子筛组份分离, 使用Bestarose 4/6 FF,上样一般在5-10%,更换缓冲液。

腺相关病毒纯化:

腺相关病毒(adeno-associated virus AAV)是微小病毒科,无包膜的20面体结构的病毒。病毒颗粒20-26nm。目前还没有发现AAV对人体致病性,重组的AVV去除了96% 的AAV基因组,进一步确保安全性,2012年10月欧洲批准了第一个基因治疗药物Glybera,就是利用重组的AAV药物。

腺相关病毒的纯化近年来有许多报道;多是采用传统的氯化铯密度梯度超速离心的方法,由于AAV耐受氯仿,所以可以使用氯仿抽提的方法纯化AAV-2 载体。氯化铯、氯仿为有毒试剂,在制药生产中使用有潜在的危害;亲和层析(AVB sepharose, Heparin等)的方法是可以使用于生产,但其产品中的残留量必须是痕量的及有经过认证的严格检测,这就增加了质检的项目和成本,对工艺的稳定性提出了更高的要求。Nicole Brument 等2002 年提出了使用2 步离子交换(SP Sepharose HP; Source15Q) 方法纯化 AAV病毒。阴离子交换是一个纯化病毒颗粒的最佳的方法,其中Q XL 可以分离AAV在表达过程中的空病毒颗粒。

AAV可以按照病毒载体的通用工艺,设计生产工艺

QXL:Q Bestarose XL 捕获病毒颗粒,同时去除空的病毒颗粒

Q Bestarose XL捕获腺病毒颗粒

腺相关病毒颗粒较小,使用凝胶过滤层析的介质可以使用Chromdex 200 PG精细纯化步骤。

Chromadex 200 分离腺相关病毒

慢病毒纯化工艺:

慢病毒包括灵长类慢病毒,如人 类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。目前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体,而其中又以HIV-1最为热门。成熟的HIV-1 病毒直径100~120nm、呈20 面体对称结构、球形,电镜下可见一致密圆锥状核心,内有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。

不同层析介质分离慢病毒载体

质粒纯化工艺:

质粒DNA (pDNA) 又称基因疫苗。是结构简单的非病毒载体, 基因疫苗又称为核酸疫苗(nucleic acid vaccine),是指将编码某种抗原的外源基因与质粒载体重组,构建出真核表达载体,通过肌肉注射等途径直接导入动物细胞后,能利用宿主细胞的蛋白质合成系统合成外源抗原蛋白,并诱导宿主细胞产生对该抗原的体液和细胞免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。由于一般的基因疫苗只含有DNA成份,因此,基因疫苗又常称为DNA 疫苗(DNA vaccine)。由基因疫苗诱导机体产生的免疫应答,称为基因免疫(gene immunization) 或核酸免疫( nucleic acid immunization ) 或 DNA 免疫(DNA Immunization),在质粒DNA 生产过程中需要去除的杂质如表1 所示的大肠杆菌中的主要成分。

3300

质粒DNA的纯化不同于病毒载体的纯化,但是不同的质粒可以使用相同的工艺平台。

质粒纯化分为以下步骤:

质粒纯化工艺路线

1.发酵是生产质粒DNA的第一的步骤,也是提高产量的一个较重要的步骤。通过优化宿主细胞、培养条件(如:培养基、温度、搅拌速度、通气量、pH等) 可以提高质粒DNA的产量。

2.细胞收集可以选用离心、膜过滤的方法。离心是实验室的常用方法,工业规模一般使用连续流离心机或膜过滤。

3.裂解细胞的方法很多,如超声破碎、高压匀浆、冻融、酶裂解、碱裂解。质粒DNA 对剪切力和化学试剂比较敏感,如果剪切力过大,质粒DNA 将变性。碱裂解的方法是常用的。NaOH+SDS 可以使得细胞膜溶解,同时促进蛋白质、核酸变性,并保持pDNA的活性。在碱裂解后,加入乙酸钾,调pH 至5.5。使染色体DNA、蛋白变性沉淀。

4.澄清:传统使用离心机固液分离后超率浓缩。此步骤既可浓缩也可以更换缓冲液。

去除RNA,使用凝胶过滤层析的组份分离模式,分离质粒DNA和RNA。

5.使用特异分离超螺旋和开环质粒的层析介质捕获超螺旋质粒。Plasimd Cap Mustang嗜硫亲和层析介质特异捕获超螺旋DNA。

6.使用阴离子交换层析介质精纯,去除内毒素等杂质。(生物谷Bioon.com)

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