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总局办公厅公开征求《辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测胶体金免疫层析法(征求意见稿)》食品快速检测方法意见

来源:食药监总局 2018-02-11 10:42

 

按照《中华人民共和国食品安全法》有关规定,为规范食品快速检测方法使用,我局组织制定了《辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测 胶体金免疫层析法(征求意见稿)》食品快速检测方法,现向社会公开征求意见。请于2018年3月10日前通过电子邮件反馈意见。

联 系 人:金绍明、成长玉

联系电话:010-67095928、010-88331033

电子邮箱:kbsbzglc@CFDA.gov.cn

附件:辣椒制品中苏丹红Ⅰ的快速检测 胶体金免疫层析法(征求意见稿)

附件

辣椒制品中苏丹红I的快速检测

胶体金免疫层析法

(征求意见稿)

1 范围

本方法规定了辣椒制品中苏丹红I的胶体金免疫层析快速检测方法。

本方法适用辣椒酱、辣椒油、辣椒粉中苏丹红I的快速测定。

2 原理

本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制了抗体和检测线(T线)上抗原的结合,从而导致检测线颜色深浅的变化,通过检测线与控制线(C线)颜色深浅比较,对样品中苏丹红I进行定性判定。

3 试剂和材料

除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。

3.1 试剂

3.1.1 乙腈。

3.1.2 无水硫酸镁。

3.1.3 正己烷。

3.1.4 二氯甲烷。

3.1.5 氢氧化钠。

3.1.6 氢氧化钠溶液(2mol/L):称取氢氧化钠(3.1.5)8g,用水溶解并稀释至100mL。

3.1.7 无水乙醇。

3.1.8 复溶液:将无水乙醇(3.1.7)与水按照体积比25:75混匀。

3.2 参考物质

苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1,纯度≥95%。

表1 苏丹红I参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量

中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量

苏丹红I Sudan I 842-07-9 C16H12N2O 248.28

注:或等同可溯源物质。

3.3 标准溶液的配制

3.3.1 苏丹红I标准储备液(1mg/mL):精密称取苏丹红I参考物质(3.2)适量,置于10mL容量瓶中,加入适量乙腈(3.1.1)超声溶解后,用乙腈稀释至刻度,摇匀,制成浓度为1mg/mL的苏丹红Ⅰ标准储备液。-20 ℃避光保存,有效期6个月。

3.3.2 苏丹红I标准中间液(1μg/mL):精密量取苏丹红I标准储备液(1mg/mL)(3.3.1)100μL,置于100mL容量瓶中,用乙腈(3.1.1)稀释至刻度,摇匀,制成浓度为1μg/mL的苏丹红I标准中间液。

3.4 材料

3.4.1 固相萃取柱:CNW Poly-sery MIP-SDR固相萃取柱(200mg/3mL),或相当者。

3.4.2 苏丹红I胶体金免疫层析试剂盒,适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。

3.4.2.1 金标微孔。

3.4.2.2 试纸条或检测卡。

4 仪器和设备

4.1 移液器:200μL、1mL和5mL。

4.2 涡旋混合器。

4.3 离心机:转速≥4000r/min。

4.4 电子天平:感量为0.01g。

4.5 氮吹仪。

4.6 水浴锅。

4.7 环境条件:温度15℃~35℃,湿度≤80%。

5 分析步骤

5.1 试样制备

取适量样品,液体样品或半固体样品充分混匀,固体样品充分粉碎混匀。

5.2 试样的提取

5.2.1 辣椒酱

称取辣椒酱2g(精确至0.01g)于15mL离心管中,加入0.5g无水硫酸镁(3.1.2)和5mL正己烷(3.1.3)提取液,涡旋振荡1min后,4000r/min离心5min。将上清液全部加入到固相萃取柱(3.4.1)中,流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱,流出液弃去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脱固相萃取柱,收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8),涡旋混合1min,作为待测液,立即测定。

5.2.2 辣椒油

称取辣椒油5g(精确至0.01g)于15mL离心管中,加入8mL正己烷(3.1.3)进行提取,涡旋振荡1min后,将上清液全部加入到固相萃取柱中,流出液弃去。再加入6mL正己烷淋洗固相萃取柱,流出液弃去。用2mL二氯甲烷(3.1.4)洗脱固相萃取柱,收集洗脱液吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8),涡旋混合1min,作为待测液,立即测定。

5.2.3 辣椒粉

称取辣椒粉3g(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入8mL乙腈(3.1.1)提取,涡旋振荡1min后,6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中,吹干后加入2mL氢氧化钠溶液(3.1.6),涡旋混匀30s后置于80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷(3.1.3),涡旋萃取30s后,6000r/min离心5min,转移上清液于新的10mL离心管中,加入无水硫酸镁(3.1.2)0.5g,涡旋振荡30s后,4000r/min离心5min,转移上清液于10mL离心管中吹干。精密加入400μL复溶液(3.1.8),涡旋混合1min,作为待测液,立即测定。

5.3 测定步骤

5.3.1 试纸条与金标微孔测定步骤

吸取200μL待测液于金标微孔(3.4.2.1)中,抽吸5~10次使混合均匀,室温温育3~5min,将试纸条(3.4.2.2)吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中,温育5~8min,从微孔中取出试纸条,进行结果判定。

5.3.2 检测卡与金标微孔测定步骤

吸取200μL待测液于金标微孔(3.4.2.1)中,抽吸5~10次使混合均匀,室温温育3~5min,将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡(3.4.2.2)上的加样孔中,温育5~8min,进行结果判定。

5.4 质控试验

每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。

5.4.1 空白试验

称取空白试样,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

5.4.2 加标质控试验

准确称取空白试样(精确至0.01g)置于具塞离心管中,加入一定体积的苏丹红I标准中间液(3.3.2),使苏丹红I添加浓度为10μg/kg,按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。

6 结果判定

通过对比控制线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。

6.1 无效

控制线(C线)不显色,表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。

6.2 阴性

检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当,表明样品中苏丹红I低于方法检测限,判定为阴性。

6.3 阳性

检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅,表明样品中苏丹红I的含量高于方法检测限,判定为阳性。

6.4 质控试验要求

空白试验测定结果应为阴性,加标质控试验测定结果应为阳性。

a) 试纸条

b) 检测卡

图1 目视判定示意图

7 结论

当检测结果为阳性时,应对结果进行确证。

8 性能指标

8.1 检测限:辣椒酱、辣椒油、辣椒粉的检测限为10μg/kg。

8.2 灵敏度:灵敏度应≥99%

8.3 特异性:特异性应≥85%。

8.4 假阴性率:假阴性率应≤1%。

8.5 假阳性率:假阳性率应≤15%。

注:性能指标计算方法见附录A。

9 其他

本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便,在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前,须对其进行考察,应满足本方法规定的各项性能指标。

本方法参比标准为GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》。

附录A

定性方法性能计算表

表A.1 性能指标计算方法

样品情况a 检测结果b 总数

阳性 阴性

阳性 N11 N12 N1.=N11+N12

阴性 N21 N22 N2.=N21+N22

总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2

显着性差异(х2)  2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),

自由度(df)=1

灵敏度(p+,%) p+=N11/N1.

特异性(p-,%) p-=N22/N2.

假阴性率(pf-,%) pf-=N12/N1.=100-灵敏度

假阳性率(pf+,%) pf+=N21/N2.=100-特异性

相对准确度,%c (N11+N22)/(N1.+N2.)

注:

a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果;

b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。

N:任何特定单元的结果数,第一个下标指行,第二个下标指列。例如:N11表示第一行,第一列,N1.表示所有的第一行,N.2表示所有的第二列;N12表示第一行,第二列。

C为方法的检测结果相对准确性的结果,与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。

本方法负责起草单位:南京工业大学。

验证单位:山东省食品药品检验研究院、中国农业科学院油料作物研究所。

主要起草人:熊晓辉、汪开银、卢一辰、王骏、王督。(生物谷Bioon.com)

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