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2017年11月CRISPR/Cas亮点盘点

来源:本站原创 2017-11-30 06:29

2017年11月30日/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

即将过去的11月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。

1.Nat Commun:新方法使得CRISPR基因编辑准确性高达98%
doi:10.1038/s41467-017-01875-9

如今,在一项新的研究中,美国威斯康星大学麦迪逊分校生物医学工程教授Krishanu Saha领导的一个研究团队开发出一种能够让这种修复不那么容易地出错的新方法。相关研究结果于2017年11月23日在线发表在Nature Communications期刊上,论文标题为“Assembly of CRISPR ribonucleoproteins with biotinylated oligonucleotides via an RNA aptamer for precise gene editing”。

与标准的CRISPR技术相比,这种新方法将按照所希望的那样精确地重写DNA序列的概率提高了10倍。这些研究人员利用一种被称作RNA适配子(RNA aptamer)的分子胶组装一种完整的CRISPR修复工具包并将这种工具包运送DNA切割位点上,从而实现这种更高的修复精准度。

与现有技术相比,新方法还有其他的几项优势。首先,这种工具包仅含有非病毒试剂,这就简化了生产过程,并降低了在未来开展遗传手术临床应用时存在的安全性问题。其次,将一种RNA适配子添加到这种工具包中要比修饰Cas9蛋白更加容易,而且提供更大的灵活性。通过添加荧光标记,这允许研究人员很容易地在一个细胞群体中鉴定出所有经过精确编辑的DNA序列。通过寻找这些荧光标签,他们能够实现98%的准确率。

2.Nature:利用CRISPR-Cas9鉴定出AML白血病的新药物靶标---METTL3
doi:10.1038/nature24678


为了鉴定出治疗急性骨髓性白血病(AML)的潜在新方法,来自英国韦尔科姆基金会桑格研究所、剑桥大学格登研究所等研究机构的研究人员在一项新的研究中,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术筛选AML细胞的弱点。他们构建出携带着在人AML细胞中可能需要加以靶向的基因发生突变的小鼠白血病细胞,并且系统性地测试每个基因,以便发现哪些基因是AML细胞存活所必需的。

这些研究人员最终筛选到46个潜在的候选基因,它们中的多数产生能够修饰RNA的蛋白。在这些基因当中,METTL3是具有最强影响的基因之一。他们发现尽管METTL3是AML细胞存活所必需的,但是它并不是健康的血细胞所必需的,这就使得它成为一种不错的潜在药物靶标。相关研究结构于2017年11月27日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Promoter-bound METTL3 maintains myeloid leukaemia by m6A-dependent translation control”。

3.Nat Commun:利用CRISPR-Cas9绘制DNA突变
doi:10.1038/s41467-017-01891-9

图片来自Nature Communications, doi:10.1038/s41467-017-01891-9。

在一项新的研究中,来自美国弗吉尼亚联邦大学的Jason Reed博士和同事们开发出一种新的纳米绘图(nanomapping)技术,这可能引发致病性基因突变诊断和发现方法变革。这种新技术将高速原子力显微镜(AFM)与一种基于CRISPR的化学条形码技术结合起来,几乎与DNA测序那样准确地绘制DNA图谱,同时更快地处理大片段的基因组。更重要的是,这种技术能够由在普通的DNA播放器中发现的部件供电。相关研究结果于2017年11月21日在线发表在Nature Communications期刊上,论文标题为“DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle”。

为了证实这种技术的有效性,这些研究人员绘制出淋巴瘤患者的淋巴结活组织样品中存在的基因易位。这些基因易位在淋巴瘤等血癌中特别普遍,但是也存在于其他的癌症中。

4.Science:重大突破!利用细菌CRISPR/Cas系统构建出世界上最小的磁带录音机
doi:10.1126/science.aao0958


在一项新的研究中,来自美国哥伦比亚大学医学中心的研究人员通过一些巧妙的分子黑客技术,将一种天然的细菌免疫系统转化为一种微型数据记录器,从而为开发将细菌细胞用于疾病诊断和环境监测等用途的新技术奠定基础。相关研究结果于2017年11月23日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Multiplex recording of cellular events over time on CRISPR biological tape”。

这些研究人员对人体肠道中普遍存在的大肠杆菌的一种普通的实验室菌株进行基因修饰,使得它们不仅记录与它们与环境之间的相互作用,而且还记录这些事件发生的时间。

论文通信作者、哥伦比亚大学医学中心病理学、细胞生物学与系统生物学系助理教授Harris Wang说,“这些被病人吞下的细菌可能能够记录它们在整个消化道中经历的变化,从而对之前无法观察到的现象产生前所未有的认识。”其他的应用可能包括环境监测,生态学和微生物学领域的基础研究。

Wang和他的同事们利用很多细菌物种中存在的一种免疫系统---CRISPR-Cas---来构建这种微型数据记录器。CRISPR-Cas系统复制来自入侵病毒的DNA片段,因此随后的细菌后代能够更加有效地抵抗这些病原体。结果就是细菌基因组中的CRISPR位点按时间顺序记录着在病毒感染中存活下来的细菌和它的祖先遭遇到的病毒感染。当这些相同的病毒试图再次感染时,这种CRISPR-Cas系统能够识别和消除它们。

5.Blood:利用CRISPR/Cas9替换T细胞受体产生优异的抗癌T细胞
doi:10.1182/blood-2017-05-787598


在一项新的研究中,来自英国卡迪夫大学的研究人员发现一种方法来提高免疫系统中的T细胞破坏癌症的能力,从而为抵抗一系列癌症提供新的希望。相关研究结果于2017年11月9日在线发表在Blood期刊上,论文标题为“CRISPR-mediated TCR replacement generates superior anticancer transgenic T-cells”。论文通信作者为卡迪夫大学医学院的Andrew Sewell教授,论文第一作者为Sewell实验室的Mateusz Legut博士。

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,这些研究人员对杀伤性T细胞(killer T-cells)进行进一步基因改造:移除它们的非癌症特异性受体,并将这些受体替换为那些能够识别和摧毁特定癌细胞的受体。

这些研究人员相信随着时间的推移,基因编辑技术的新改进将会彻底改变癌症免疫疗法,史无前例地提高它们的疗效,并让它们适用于更广泛的不同类型的疾病患者群体。

6.Science:CRISPR专利战争突显授予保护范围广泛的专利权问题
doi:10.1126/science.aao2468

图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。 

美国杜克大学法学教授Arti Rai和亚利桑那州立大学生物技术教授Robert Cook-Deegan在一篇知识产权政策论坛论文中谈及了基因编辑专利战争。他们提出在一些产权纠纷中,相比于首次发明的人,法院应当有更多的考虑。以CRISPR-Cas9等技术为例,他们声称应当将一些想法(和权利)赋予给作为与这种技术相关的未来研究工作的受益者的公众。相关论文发表在2017年11月17日的Science期刊上,论文标题为“Racing for academic glory and patents: Lessons from CRISPR”。

CRISPR-Cas9是一种前沿的基因编辑技术。鉴于很多研究人员正在利用它开展基因编辑研究,它一直在新闻报道中出现。但是它得到广泛报道的另一个原因是两方正在声称他们发明了它。这两方是美国加州大学和布罗德研究所。据称,因许可权的存在,专利权将为这场专利战争的最终赢家带来大量的收入。

正如Rai和Cook-Degan所指出的那样,由于1980年拜杜法案(Bayh-Dole Act)的通过,诸如此类的专利战争已经进行了几十年。拜杜法案允许实体获得联邦资助的研究工作成果的专利。在这场CRISPR专利战争中,双方都获得美国国家卫生研究所(NIH)的资助,并且都申请了专利,但是申请的时机是不明朗的。但是也正如这两名作者所指出的那样,在法律纠纷中不应该丢失或忽视的是公众的权利。如果一方在这场专利战争中获胜,那么应设法控制谁能够使用这种基因编辑技术和以何种方式使用。在将这种完全所有权授予给一个实体的情形下,法院可能以一种有害的方式阻碍基因研究。如果一组研究人员在消除一种遗传病中正在取得进展但因不能够获得专利许可而进展缓慢,该如何处理?无辜的人可能因为法院的裁决而受到损害。这两名作者提出解决方法就是在这些情形下,让法院不再授予保护范围广泛的专利权,而是授予保护范围狭窄的专利权,这就让专利权持有者享有一些权利,但不是全部权利,从而为前沿技术创造一种更加开放的体系。

7.PNAS:“基因剪刀”改造出三眼蚊子
doi:10.1073/pnas.1711538114


据美国加州大学河滨分校官网近日消息,该校科学家利用“基因剪刀”工具,培育出了多个特征发生改变的埃及伊蚊,这些黄色蚊子拥有三只眼睛、翅膀发育畸形。他们希望这些由基因编辑工具改造出的蚊子,能帮助预防和控制蚊媒传播疾病。研究发表在最新一期的美国《国家科学院院刊》上。

现在,研究人员对埃及伊蚊进行了基因改造,使其生殖细胞系能稳定地表达Cas9酶,这种酶在目前流行的基因编辑工具“CRISPR/Cas9”中发挥了关键的“剪刀”作用。之后,研究人员使用CRISPR技术,对伊蚊的DNA(脱氧核糖核酸)进行了有针对性的高效编辑。

研究人员对蚊子体内与表皮、翅膀和眼睛发育有关的基因进行干预或破坏,最终培育出了黄色的、拥有三只眼睛、翅膀畸形的蚊子。比如,基因编辑工具对与表皮色素有关的基因进行干预后,蚊子从黑色变成了黄色;与眼部色素相关的基因被破坏后,蚊子眼睛的颜色也从黑色变成了白色。

8.Nat Biotechnol:重磅!科学家开发出能携带CRISPR系统的新型纳米颗粒 可实现对细胞基因组的精准编辑
doi:10.1038/nbt.4005

图片来源:MIT。

近日,刊登在国际著名杂志Nature Biotechnology上的一篇研究报告中,来自MIT的科学家开发出了一种新型纳米颗粒,这种纳米颗粒能够运输CRISPR基因编辑系统,并对小鼠机体的基因进行特异性修饰;因此研究人员就能够利用纳米颗粒来携带CRISPR组分,从而就消除了使用病毒的需要。

利用这种新型的运输技术,研究者就能对大约80%的肝脏细胞进行特定基因的切割,这或许就能达到目前在成体动物中应用CRISPR技术的最佳成功率。 研究者Daniel Anderson教授说道,让我们非常激动的是,我们制造了这种特殊的纳米颗粒,其能被用来永久特异性地编辑成年动物机体肝细胞中的DNA;本文研究中,研究者所研究的一种名为Pcsk9的基因能调节机体胆固醇的水平,而人类机体中该基因的突变或许和一种名为家族性高胆固醇血症的罕见疾病有关,目前FDA批准的两种抗体药物能够抑制Pcsk9基因的表达,然而这些抗体药物需要在患者后半生中定期服用,而新型的纳米技术或能永久性地对该基因进行编辑,同时就为治疗这种罕见疾病提供了新的治疗思路。

9.Nat Commun:基因编辑CRISPR-Cas9研究获新成果
doi:10.1038/s41467-017-01496-2


复旦大学生命科学学院、遗传工程国家重点实验室黄强课题组与卢大儒课题组合作的关于基因编辑系统CRISPR-Cas9的研究成果在线发表于国际知名学术期刊《自然·通讯》(Nature Communications)。该成果用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析了CRISPR-Cas9的DNA剪切活性结构,在CRISPR-Cas9的DNA剪切机理研究方面取得了重要进展。

过去几年,众研究机构陆续解析了多个“Cas9-sgRNA-DNA靶链”的三元复合物晶体结构。然而,这些复合物结构并没有完全揭示出真正的DNA剪切活性构象,人们对CRISPR-Cas9如何通过HNH与RuvC核酸酶域切割DNA单链的分子机制还很不明确。因此,获得CRISPR-Cas9的剪切活性结构成为了揭示该系统DNA剪切机理的关键。

针对上述研究问题,黄强与卢大儒研究团队早在2014年就考虑采用冷冻电镜方法来解决。他们首先构建了酿脓链球菌Cas9酶 (SpCas9)、sgRNA和DNA的三元复合物,然后用冷冻电镜单颗粒三维重构方法解析该复合物的溶液结构,获得了一个5.2埃分辨率的冷冻电镜结构 。

复合物结构的原子模型显示,在已解析的所有结构中,该复合物的HNH酶活性中心最接近DNA链的切割位点;分子动力学模拟及点突变实验表明,该复合物的HNH和RuvC核酸酶活性中心的催化氨基酸可以与DNA解旋单链形成切割反应所需构象。因此,研究获得的复合物结构是CRISPR-Cas9的DNA剪切激活构象,为全面揭示剪切机理提供了关键的活性结构信息,并为应用蛋白质工程技术优化该系统、降低其脱靶效应提供了重要的结构生物化学基础。目前,研究团队正在所得结构的指导下,应用蛋白质设计方法对CRISPR-Cas9系统进行优化,以开发脱靶效应低、编辑效率高的新型基因编辑系统。

10.Nat Genet:新方法可校正CRISPR筛选的癌症基因依赖性数据中的假阳性
doi:10.1038/ng.3984


在一项新的研究中,布罗德癌症依赖性图谱(Broad Cancer Dependency Map)团队将来自342种癌细胞系的基于CRISPR的数据添加到他们不断增加的癌症基因依赖性目录中,并且提供一种新的方法来确保这些数据的准确性。相关研究结果于2017年10月30日在线发表在Nature Genetics期刊上,论文标题为“Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR–Cas9 essentiality screens in cancer cells”。

为了限制这些假阳性结果,布罗德癌症依赖性图谱计划---一个将来自布罗德癌症项目的阿喀琉斯计划团队和癌症数据科学团队、布罗德研究所基因扰动平台和其他的布罗德研究所团队的研究人员召集在一起的联合计划---开发出一种被称作CERES的计算方法,该方法可对汇集的CRISPR筛选数据进行拷贝数效应校正,并且针对癌细胞的基因依赖性提供给一种无偏见的看法。

正如布罗德癌症依赖性图谱团队在这项研究中报道的那样,他们利用CERES对来自342种癌细胞系的全基因组CRISPR-Cas9筛选数据(迄今为止产生的最大CRISPR敲除数据集)进行校准,这些癌细胞系是由布罗德-诺华癌细胞系百科全书(Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE)进行管理的。这种方法极大地降低这些数据中的假阳性结果,准确地找到了已知的基因依赖性(如KRAS基因突变),并且允许新的基因依赖性浮现出来。

11.PNAS:中科院科学家培育出基因编辑瘦肉猪
doi:10.1073/pnas.1707853114


中国科学家23日宣布,他们利用基因编辑方法培育出一批健康的瘦肉猪,比正常猪脂肪少24%。这项工作由中国科学院动物研究所赵建国领导完成,论文发表在新一期美国《国家科学院学报》上。一些专家认为,这是一个重要进展。但也有人怀疑民众对基因编辑瘦肉猪的接受程度。

赵建国研究团队通过新一代基因编辑工具CRISPR,向猪细胞内插入一种叫解偶联蛋白1(UCP1)的基因,减少脂肪沉积,增加瘦肉率,最终培育出的猪比正常猪脂肪少24%。

他们通过基因编辑工具将UCP1基因定点整合到猪胎儿的成纤维细胞的基因组中,培育出2500多个克隆猪胚胎,然后将这些胚胎注入13只代孕母猪体内,其中3只母猪怀孕并产下12只雄性仔猪。与野生型猪相比,这些仔猪体温调节能力显着增强,但脂肪率和膘厚度显着降低,瘦肉率显着提高。分析表明,UCP1基因主要通过促进脂肪水解来减少脂肪沉积,降低脂肪率。

12.Genome Biol:上海生科院完整敲除研究获进展,可选择性消除单条染色体
doi:10.1186/s13059-017-1354-4


11月25日,《基因组生物学》发表了题为《CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除目标染色体》的研究论文,该研究由中科院神经科学研究所、脑科学与智能技术卓越创新中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组与北京大学胡家志实验室合作完成。该研究介绍了CRISPR/Cas9技术的新型应用,即在细胞、胚胎或体内组织中,针对目标染色体进行多个DNA剪切,可以选择性消除单条染色体。CRISPR/Cas9介导的目标染色体消除为动物模型的建立以及非整倍体疾病的治疗提供了新的策略与方法。

II型细菌的CRISPR/Cas9系统由Cas9 核酸酶和单链引导RNA(sgRNA)组成,已经被改造成一个高效的基因编辑工具,能显著地提高编辑基因组的能力。sgRNA引导Cas9到达特定的基因组区域,剪切形成双链DNA缺口,该缺口可以通过两种方法修复——非同源染色体末端连接修复或同源重组修复。CRISPR/Cas9基因编辑技术已经应用于生产精确基因突变、重组和染色体片段敲除的细胞或动物。而研究者提出CRISPR/Cas9基因编辑技术是否可以用于整条染色体的消除,进而对建立染色体缺失的动物模型以及非整倍体疾病的治疗提供新的途径。

为了验证这个想法,研究人员首先证明应用CRISPR/Cas9介导的针对Y染色体的多位点DNA切割可以有效地将小鼠胚胎干细胞的Y染色消除。这种多位点剪切可通过单个sgRNA靶向结合多个特异的染色体位点,或者通过14个sgRNA分别结合各自的特异位点来达到。此外,他们还发现小鼠X染色体,人的7号和14号染色体都可以通过这种方法消除。更为重要的是,唐氏综合症病人的iPS细胞中的21号染色体也可以通过这种方法特异性消除。因此,该研究第一次证实了性染色体和常染色体可以通过基因编辑特异性消除。

13.Genome Res:世界首例!科学家培育出带有基因剪刀的工具猪
doi:10.1101/gr.222521.117


11月16日,中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学课题组的最新研究成果“Cre-dependent Cas9-expressing pigs enable efficient in vivo genome editing”在线发表在Genome Research(《基因组研究》)上。该研究首次构建了新型条件性表达Cas9基因工具猪模型,利用此模型,率先实现了直接对成体大动物进行体内基因编辑,并首次建立了大动物原发性肺癌模型。

研究人员利用基因打靶技术,成功地将能够剪开基因的Cas9蛋白基因插入到猪基因组的一个特定的位点(ROSA26),相当于在猪体内加入了一把基因剪刀,并且在Cas9基因附近加上了能与Cre重组酶结合的loxp位点,后者相当于一个开关,能对其剪切功能的开启加以控制。研究人员利用此工具模型,不需要依赖受精卵注射或体细胞核移植技术,在动物体内转入能识别特定基因的gRNA和重组酶,就可直接对猪的基因组进行编辑,从而快速获得相应基因编辑猪模型。

研究人员将包装的含有Cre重组酶和靶向六种肿瘤相关基因的gRNAs慢病毒通过滴鼻方式,感染工具猪的肺脏,在猪肺细胞的基因组发生癌化突变。三个月后,猪出现了典型的肺癌症状和病理变化,从而成功地建立了原发性肺肿瘤大动物模型。

14.FEBS J:艾滋病新突破,CRISPR基因编辑技术再立一大功艾滋病新突破,CRISPR基因编辑技术再立一大功
doi:10.1111/febs.14293


在对抗艾滋病的道路上,全世界的科学家们一直在努力着,这些年来,对抗艾滋病的疗法也取得了很大的进展。艾滋病之所以可怕是因为艾滋病毒会通过摧毁人类的免疫系统而伤害感染者的身体,感染艾滋病毒的患者基本上都不是因为艾滋病毒而死,而是由于残缺的免疫系统使他们变得“遍体鳞伤”。据研究,艾滋病毒会感染大脑中的某些细胞,这些细胞是小胶质细胞,同时,被感染的小胶质细胞释放有毒和炎性分子,削弱或杀死周围的神经元,引起神经认知障碍的问题。

长久以来,研究人员一直在寻找方法,了解艾滋病毒引起的神经认知障碍,然而,始终没有大的进展,研究人员对于艾滋病病毒和小胶质细胞作用的了解非常有限。然而,最新发表的一项研究提供了新的见解,在新的研究中,科学人员使用CRISPR / Cas9基因编辑技术,开发了一种新型的艾滋病毒感染小胶质细胞模型。

研究人员在报告中表示:“在此次研究中,我们运用CRISPR / Cas9基因编辑技术所设计的新模型,有助于我们了解由艾滋病毒引起的神经认知障碍,这一发现将会带来治疗艾滋病的新策略。”(生物谷 Bioon.com)

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