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自噬凋亡,相爱相杀

来源:解螺旋、医生科研助手 2017-11-23 17:34

这次要讲的文献题目是“抗-miRNA-30b通过增强细胞自噬抑制TNF-α诱导的细胞凋亡和软骨降解”


最近好多地方都在讲怎么速读文献,那就凑个热闹,借这篇文章顺道说下个人浏览习惯:

①看Title和Keywords确定要不要浏览;

②看图和图下注释,了解文章做了什么怎么做的,进一步确定要不要精读;

③从头精读。不是写文章的情况下,前言和讨论通常是不看的。


所以,摘要我也是不看的。。。。。。

 

TNF-α是一种诱导细胞凋亡的炎性细胞因子,TNF-α诱导ATDC5细胞系活力降低,凋亡增加。即TNF-α处理细胞,建立细胞模型。

Fig.1(A) CCK-8试剂盒检测细胞活力,较高浓度TNF-α(10ng/mL或者20ng/mL在12、24、48小时细胞活力显著降低)。

Fig.1(B) 用Hoechst 33342染色进一步证实高浓度TNF-α下活细胞数量显著减少,在TNF-α处理的细胞中观察到染色质凝聚、断裂等细胞凋亡特征。

Fig.1(C、D)20ng/ml TNF-α处理,WB检测细胞凋亡指标caspase 3和caspase 9的表达量上调。


TNF-α诱导ATDC5细胞的自噬变化(建立模型)

Fig.2(A) 将GFP-LC3B表达质粒转染细胞,并用TNF-α、Rap(自噬活化剂)或3-MA(抑制剂自噬)处理。与对照组相比,Rap活化剂组:GFP标记斑点显示的自噬体形成数量显着增加;3-MA抑制剂组自噬体数量显著降低,证明GFP标记质粒转染法的有效性。TNF-α组自噬体数量增加,表明TNF-α对细胞自噬具有正向调节作用(即细胞模型成功建立)。

LC3是细胞自噬泡膜通用标记物,构建LC3蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白,当自噬发生时,在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光。

Fig.2(B) 蛋白质印迹法分析四组自噬相关蛋白BECN1、ATG5、LC3B-II和p62的表达。与对照组比,TNF-α组自噬基因BECN1、ATG5、LC3B-II表达上调,p62表达下调。证明TNF-α对ATDC5细胞自噬具有正调节作用(细胞模型成功建立)。


miRNA-30b直接作用于BECN1和ATG5

Fig.3(A)在BECN1和ATG5 mRNA的3'-UTR区域内推定miRNA-30b的结合位点。扩增含有miRNA-30b结合位点的片段,并将其构建到pGL3质粒中;将结合位点突变,构建质粒。分别构建:BECN1-WT、ATG5-WT、BECN1-mut(突变)、ATG5-mut(突变)。转染入ATDC5细胞,测定荧光强度。

Fig.3(B)miR-30b与BECN1-WT组荧光强度显著降低,说明miR-30b与BECN1有结合使BECN1表达降低。miR-30b与ATG5-WT组荧光强度显著降低,说明miR-30b与ATG5有结合使ATG5表达降低。

Fig.3(C)用miR-NC、miR-30b、antimiR-NC和antimiR-30b转染细胞,RT-PCR分析BECN1和ATG5的mRNA表达水平,在miR-30b存在条件下BECN1和ATG5表达降低。

Fig.3(D)蛋白质印迹分析在蛋白水平显示出了类似结果。以上结果表明miR-30b具有调节自噬基因表达的作用。


miR-30b下调TNF-α诱导的自噬和ATDC5细胞中自噬基因的表达(miR-30b对细胞模型的自噬调节)


用GFP-LC3B质粒转染模型细胞,检测荧光自噬体数量。

Fig.4(A) miR-30b组自噬体形成显著减少;抗-miR-30b组自噬体形成显著增多。

Fig.4(B) 蛋白质印迹分析:抗-miR-30b上调自噬基因LC3-II的表达,下调P62降解蛋白的表达,与miR-30b作用正好相反。miR-30b下调了细胞模型的自噬作用。

 


抗-miR-30b通过增强自噬来抑制TNF-α诱导的细胞凋亡

TNF-α诱导ATDC5细胞自噬和凋亡,作者接下来想要了解miR-30b & 抗-R-30b对TNF-α诱导的ATDC5细胞模型的凋亡影响。

Fig.5(A) 与未处理细胞相比,TNF-α诱导ATDC5细胞凋亡。与TNF-α组相比,自噬诱导剂RAP处理可以降低细胞凋亡指数,自噬抑制剂3-MA增加细胞凋亡指数,表明细胞自噬和凋亡间成反比关系。miR-30b促进了TNF-α诱导的细胞模型凋亡,抗-miR-30b抑制了TNF-α诱导的细胞模型凋亡。

Fig.5(B) Western blot分析,在TNF-α诱导的细胞模型中,miR-30b上调caspase 3和caspase 9;抗-miR-30b下调caspase 3和caspase 9。作者得出结论:miR-30b可以协调自噬和凋亡之间的平衡,调节TNF-α诱导的ATDC5细胞稳态。

 

抗miR-30b通过增强自噬来调节TNF-α诱导的ECM(细胞外基质)降解

Fig.6(A) RT-PCR检测ECM降解相关基因表达,与control相比,TNF-α组ACAN、Col2A和SOX9基因表达显著下调,MMP13显著上调(模型,没毛病)。

Fig.6(B) RT-PCR检测miR-30b和抗-R-30b对TNF-α诱导的细胞模型ECM降解的作用。miR-30b组ACAN、Col2A、SOX9的mRNA表达显著下调,MMP13的mRNA水平显著上调。抗miR-30b组结果相反。

Fig.6(C) miRNA(antimiR-NC、antimiR-30b)转染前12h,分为自噬抑制剂(3-MA)处理组与不处理组。与无3-MA组相比,3-MA组ACAN、Col2A、SOX9的mRNA水平显着下调,MMP13的mRNA水平显着上调。3-MA能够阻断抗-miR-30b作用。表明抗-miR-30b对自噬具有调节作用。

Fig.6(D) 作者认为自噬参与了老化和骨关节炎的发展过程。通过RT-PCR检测抗-miR-30b对软骨基质产生的影响,测定相关代谢因子表达。MMP2、ADAMTS-4相对mRNA水平降低,基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1、TIMP-3增高,进一步支持抗-miR-30b减弱软骨降解的作用。

 



关于速度:


个人习惯,只阅读标题和图片(结果)部分。Introduction和Discussion部分通常当做了解某一领域的综述来看。

对于刚接触科研的小白来说,不要单纯相信速读,前期踏实的阅读积累才是重点,后期再借鉴别人方法,速度自然就会上来。

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