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梳理牙髓干细胞最新研究进展

来源:本站原创 2017-10-30 23:00

2017年10月30日/生物谷BIOON/---人牙齿干细胞(dental stem cells, DSC)可分为牙齿上皮干细胞(Dental epithelial stem cells)和牙齿间充质干细胞(Dental mesenchymal stem cells)两类。胚胎口腔上皮诱导牙形成(odontogenesis)。牙釉质是由牙齿成釉细胞(ameloblastst)形成的,而牙齿成釉细胞是由牙齿上皮干细胞产生的。在牙形成中发挥作用的细胞当中,牙齿上皮干细胞是唯一具有外胚层起源的细胞。牙齿上皮干细胞的来源是位于牙根尖上皮中的根尖蕾细胞(apical bud cells, ABC),它们导致牙釉质持续产生。除了具有外胚层起源的牙齿上皮干细胞之外,参与牙形成的所有干细胞具有间充质起源。

牙齿间充质干细胞包括牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSC)、人脱落乳牙干细胞(stem cells of human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)、牙滤泡干细胞(dental follicle stem cells, DFSC)、牙根尖乳头干细胞(stem cells of the dental apical papilla, SCAP)。

2000年施松涛教授在牙齿中发现了干细胞,并命名牙髓干细胞,2003年施教授从脱落的乳牙牙髓中成功分离干细胞,并命名为脱落乳牙牙髓干细胞。牙髓干细胞指的是牙髓细胞中形态呈梭形,可自我更新和多向分化,有较强克隆能力的细胞。

牙髓干细胞由于其卓越的再生能力,在牙周组织、肝脏、神经元、骨骼肌组织、其他组织之间的血管再生以及治疗由糖尿病引起的肢体组织缺血、股骨头坏死引起的骨损伤、灼伤引起的皮肤损伤均有较好的疗效。再者,牙髓干细胞能再生并通过分化替换丢失的神经元,因而有潜力用于治疗神经系统疾病。此外,牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞相媲美的免疫调节能力。研究表明牙髓干细胞可以成为免疫抑制的药物,可以用于口腔炎症,及其他慢性炎症。

1.J. Breath Res.:首次利用臭鸡蛋气体将人牙髓干细胞转化为肝细胞
doi:10.1088/1752-7155/6/1/017103

日本科学家发现造成口臭(halitosis)的气味难闻的化合物非常适合用于收集从人牙髓(dental pulp)中提取的干细胞。2012年2月27日,这些研究结果发表在Journal of Breath Research期刊上。

在这项研究中,研究人员证实硫化氢(hydrogen sulphide, H2S)能够增加成体干细胞分化为肝细胞的能力,从而提高成体干细胞作为未来肝细胞治疗的一种可靠来源的名声。这是第一次发现肝细胞能够产自人牙髓,而且更让人印象深刻的是,它们能够大量生产同时保持高纯度。

在这项研究中,Ken Yaegaki博士和来自日本齿科大学的同事们利用来自牙髓---牙齿的中央部分,由结缔组织和细胞组成---的干细胞进行研究,其中这些干细胞是从正在接受常规拔牙的牙科患者的牙齿中获得的。

一旦干细胞被制备得足够多,它们就被分成两个批次(测试组和对照组)并且测试组细胞在H2S培养箱中孵育。在3天、6天和9天之后,它们分别被收集下来进行分析以便观察这些细胞是否成功地转化为肝细胞。

为了测试这些干细胞在H2S影响下是否能够成功地分化为肝细胞,研究人员进行一系列测试来研究干细胞分化产生的细胞是否拥有肝细胞的典型特征。除了在显微镜下的物理观察之外,研究人员研究了它们储存糖原的能力,并记录了细胞中尿素含量。

Yaegaki博士继续说道,直到现在,没有人发明出再生大量肝细胞用于人类移植的实验方法。相比于利用胎牛血清生产肝细胞的传统方法,我们的方法产率高,而且更为重要的是,它也更安全。

2.Sci Rep:牙齿竟然有办法自然修复!牙髓内的天然干细胞功不可没!
doi:10.1038/srep39654


最近,发表在《自然》杂志子刊《Scientific Reports》的报告显示:来自英国伦敦国王学院的科学家发现,利用一种治疗阿尔茨海默病的药物Tideglusib,能够激活位于牙髓内天然干细胞自我更新,让病损牙齿自然修复。牙齿竟然有办法自然修复!这项研究绝对是一项巨大的科学进步。

英国科学家找到的这种让牙齿自然修复的新方法,不是依靠人工填充物,而是利用了原本用于阿尔茨海默病的小分子药物Tideglusib,来激活牙髓内干细胞不断自我更新发育,生成新的牙髓、牙本质(牙本质很坚硬,是保护牙齿的重要结构),可用来填充修复较大牙洞。实验数据显示,Tideglusib用药6周后,牙洞缺损几乎完全修复,新生牙髓清晰可见。这种让牙齿自然修复的生物学方法,颠覆了依靠人工填充固有技术。

3.J Endod:抗微生物肽LL-37对牙髓干细胞增殖和分化的影响
doi:10.1016/j.joen.2017.08.010


这篇研究的目的是为了在体外评估5和10 μg/mL LL-37的生物相容性以及它对牙髓干细胞(DPSCs)向成牙本质细胞样细胞分化的影响。

研究对DPSCs分别施加5和10 μg/mL LL-37后,检测了细胞活力、基因毒性、一氧化氮产量、细胞周期、牙本质涎磷蛋白(DSPP)产物以及DSPP基因的表达情况变化。

结果显示,5和10 μg/mL浓度的LL-37没有细胞毒性,并且可以普遍上调细胞活性,特别是在培养的第3天(P < .05)。然而,LL-37在任何一个浓度下都未曾明显改变一氧化氮产量。细胞周期的分析显示,10 μg/mL的LL-37在G0/G1期阻断细胞增殖(P < .05)。对照组在细胞周期的其他阶段展现出更多的细胞数量(P < .05)。同样,10 μg/mL的LL-37组DSPP基因和蛋白的表达也明显高于其他组(P < .05)。

结论:这些结果表明,LL-37在受检浓度表现出良好的生物相容性,并且它可以增加活性细胞的数量,特别是在初始期。10 μg/mL的浓度阻碍细胞周期,但是可以促进DSPP基因和蛋白的表达,表明LL-37肽可以促进成牙本质细胞分化。

4.J Endod:牙髓干细胞---使用支架材料在神经移植术和血管发生中的潜力
doi:10.1016/j.joen.2017.06.001


在这篇研究中,学者们主要通过对hDPSCs的研究来探索牙髓再生以及表现为神经元和Schwann细胞再生能力受限的末梢神经损伤的干细胞疗法。

在此项研究中,研究者发开了一种促使hDPSCs向神经元分化的方法,它需要在神经元成熟前形成神经球。研究团队通过hDPSCs向Schwann细胞分化的实验发现,分化了的hDPSCs具有生成髓鞘以及引导背根神经节形成神经突的能力。另外,除了动态分化能力,hDPSCs对神经和内皮细胞还展现出一种旁分泌作用。对hDPSCs的条件培养基分析显示,其分泌的广谱生长因子包括:脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长因子和胶质细胞衍生神经营养因子。应用此种条件培养基培养内皮细胞,可以促进细胞迁移和血管发生,表明存在一种旁分泌的促血管生成作用。当存在hDPSCs时,绒毛尿囊膜测定显示血管形成增强,进一步加强了对这种说法的确定性。

此外,将包含肽水凝胶和hDPSCs的3维打印羟基磷灰石支架植入免疫抑制的小鼠体内,结果发现血管内生、髓样组织形成和骨性牙本质沉积,表明存在hDPSCs的成骨/成牙本质分化。此外,研究团队未来的探索方向将会集中于对hDPSCs的牙髓再生能力和牙髓细胞外基质中成纤维细胞扮演角色的研究。

5.J Endod:三维球形培养使牙髓细胞具有独特的多能潜力
doi:10.1016/j.joen.2017.03.016


三维(3D)球形培养是最广泛应用于体内微环境的3D培养技术之一。这篇研究是将DPSCs经过三维球形培养后,观察细胞干性和多向分化能力变化。

研究将DPSCs在无血清培养基中分离培养,并检测其成球能力。多能转录因子的表达通过反转录定量聚合酶链式反应和Western blot进行检测。通过流式细胞仪检测MSC相关标记物的表达情况。多向分化能力通过碱性磷酸酶、茜素红S和油红O进行检测。裸鼠皮下埋植实验检测来源于DPSCs的球形细胞和单层融合细胞的体内矿化组织形成能力。

结果显示,DPSCs可以成球。与相应的单层融合培养的细胞相比较,成球的DPSC表现出不同的干细胞表型,它强烈表达多能转录因子,而MSC相关标志物表达降低。另外,成球DPSC体外多向分化能力明显增强,并且多向分化相关基因表达显著升高。此外,DPSC成球细胞与单层融合细胞相比,体内矿化组织形成能力明显增强。

6.J Endod:氯化钴可以增加人牙髓细胞的干细胞特性
doi:10.1016/j.joen.2017.01.005


缺氧是调控干细胞干性的一个影响因素。本项研究是在体外向hDPC施加化学制剂氯化钴(CoCL2)刺激,通过检测细胞增殖情况、干细胞标志物表达变化和成骨分化情况来评估CoCL2是否可以模拟缺氧环境影响hDPC的干性。

向体外培养的hDPC分别施加25或50 μmol/L CoCL2刺激。细胞增殖情况通过3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide进行检测。流式细胞仪检测stro-1阳性细胞数量。干细胞标志性基因REX1, OCT4, SOX2和NANOG mRNA表达和成骨分化标志性基因ALP, COLI和RUNX2 mRNA表达通过RT-PCR或者实时PCR进行检测。成骨分化通过ALP活性和矿化定量进行分析。

结果显示,尽管25和50 μmol/L CoCL2抑制hDPC的细胞增殖,但50 μmol/L CoCL2可以增加stro-1阳性细胞数量。不仅如此,CoCL2呈剂量依赖性的诱导干细胞标志性基因的表达。除此之外,CoCL2抑制成骨分化相关基因表达、ALP活性以及钙沉积。另外,额外施加apigenin(低氧诱导因子-1α的抑制剂),可以恢复CoCL2对ALP活性的抑制作用。

7.J Dent Res:牙髓细胞植入无法诱导部分牙髓切断术后的牙髓再生
doi:10.1177/0022034517725523


基于细胞疗法的部分牙髓再生是一种较有希望获得新生功能性牙本质-牙髓复合体的方法。它依赖于健康活髓的保存以再生受损的髓组织。这篇研究是将猪的DPCs植入迷你猪的牙髓缺损处,评估牙髓再生过程是否可以实现。

研究通过分口模型,在磨牙和前磨牙的显微外科牙髓切断术后,应用自体组装注射用纳米肽水凝胶,混合或不混合pDPCs,植入牙髓缺损处。术后21天,对施治牙齿进行3维形态表征测定、Masson三色染色和免疫标记DSP和BSP(牙本质涎蛋白和骨唾液蛋白)。

研究表明,细胞植入没有促使牙髓再生,但是发现有规则的修复性牙本质形成。事实上,在支架中不存在pDPCs时,会形成有规则的骨性牙本质桥微结构,这与天然牙本质显著不同。而存在pDPCs会明显影响牙本质桥的显微结构。另外,在每颗治疗牙齿的根部区域,都存在剩余牙髓组织充血和牙根外吸收的情况。

8.J Endod:牙髓来源的间充质干细胞特性与培养条件的影响
doi:10.1016/j.joen.2017.06.004

牙髓间充质干细胞(DPMSCs)高表达间充质干细胞标记物,并且具有分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的潜能。因此,DPMSCs被认为适合应用于组织再生。集落分离法通常被用来相对大量收集异种DPMSCs。而同源DPMSCs可以利用抗间充质干细胞标记物抗体通过荧光活化细胞分选系统进行分离,虽然此种方法分离的细胞产率很低。DPMSCs的数量和质量对再生疗法均十分重要,并且细胞培养方法还有待于进一步提高。因此,这篇研究的目的是通过不同方法培养DPMSCs,并检测DPMSCs的特性。

研究将DPMSCs置于3维球形培养系统,类似于促使胚胎干细胞分化的悬滴培养环境。结果显示,3维球形培养系统促进了成牙本质/成骨分化标记物的表达和矿化结节的形成。结果表明,3维球形培养系统可能适合诱导DPMSCs形成硬组织。由于细胞培养密度会影响干细胞特性,因此研究者进一步检测了细胞培养密度对DPMSCs特性的影响。与稀疏条件相比,以细胞融合时的密度培养DPMSCs会轻微降低一些间充质干细胞标记物的表达。而融合培养会增强DPMSCs分化为形成硬组织细胞的能力,表明融合培养可能不适合维持DPMSCs的干性。

9.J Endod:Piezo通道在超声刺激的牙齿干细胞中的作用研究
doi:10.1016/j.joen.2017.02.022


Piezo1和Piezo2是机械感应膜离子通道。研究者推测:在牙齿细胞中,Piezo蛋白对超声相关的机械信号转导以及下游胞外信号调节激酶(MAPK)信号的激活都可能起到一定的作用。这篇研究分别向牙髓干细胞(DPSCs)和牙周膜干细胞(PDLSCs)施加低强度的脉冲超声(LIPUS)刺激,检测Piezo通道的表达和作用。

细胞增殖情况通过溴脱氧尿苷掺入进行评估。Western blot检测增殖细胞核抗原以及转录因子c-fos和c-jun的蛋白表达变化。细胞施加LIPUS刺激后,酶联免疫吸附测定法和western blot检测MAPK活性。细胞施加Piezo离子通道阻断剂-钌红(RR)刺激,检测Piezo蛋白在LIPUS刺激的细胞增殖和MAPK信号中的功能和作用。

Western blot结果显示,在2种细胞中均存在Piezo1和Piezo2的表达。施加LIPUS刺激的24 h后,DPSCs中Piezo蛋白的表达水平显著上调,而在PDLSCs中未观察到Piezo的明显变化。施加RR刺激显著抑制了LIPUS诱导的DPSCs增殖,而非PDLSCs。在施加LIPUS刺激后的24 h内,DPSCs中胞外信号相关激酶(ERK)1/2 MAPK信号处于持续的激活状态,而在PDLSCs中,磷酸化的c-Jun氨基末端激酶和p38胞外信号调节激酶MAPK的表达上调明显。RR在2种牙齿细胞类型中均可以影响MAPK信号活性,并且对ERK1/2/MAPK磷酸化水平的作用最为突出;而RR在DPSCs内对LIPUS诱导的ERK1/2活性增强起到明显的抑制作用表明,LIPUS刺激DPSCs的增殖涉及Piezo所介导的ERK1/2/MAPK信号调控。

10.J Endod:血管内皮生长因子与骨形成蛋白2对人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的并用效果研究
doi:10.1016/j.joen.2017.01.036


这篇研究的目的是为了评估协同并用血管内皮生长因子(VEGF)与骨形成蛋白2(BMP-2)是否可以增强体外培养的人牙髓干细胞(DPSCs)的成骨/成牙本质分化。

成骨/成牙本质分化培养基(OM)或生长培养基体外培养DPSCs,并施加不同浓度的VEGF和/或BMP-2刺激21天。茜素红染色(ARS)观察细胞矿化形成情况。不同浓度的VEGF和BMP-2协同并用,向DPSCs施加刺激21天。实验分组:组1:OM;组2:OM+VEGF;组3:OM+BMP-2;组4:OM+VEGF+BMP-2(亚组:组4a:VEGF刺激最初的7天,组4b:BMP-2刺激最后的14天,组4c:VEGF+BMP-2刺激21天)。随后,细胞进行定量ARS分析,或收集细胞进行定量聚合酶链式反应,观察核心结合因子α1(CBFA1)、碱性磷酸酶(ALP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达改变。

结果显示,在未进行OM培养下,VEGF和/或BMP-2均无法诱导DPSCs的矿化形成。与OM相比,OM+VEGF可以诱导更多的矿化形成(P < .05),而不是OM+BMP-2。在共同施加刺激的分组中,OM+VEGF组和组4a的诱导矿化能力最强,要明显优于OM组或其他组(P < .05)。定量聚合酶链式反应结果显示,组2、3和4a的CBFA1、ALP和DMP-1表达水平要明显高于组4b和4c(P < .05)。而ALP的表达水平只有组4a明显高于OM组(P < .05)。另外,3种基因的表达在组2和组3之间未见明显差异(P > .05)。

11.新型补牙填充物有望使受损牙齿自愈

据美国《大众科学》杂志近日报道,美国和英国研究人员研发出一种新型补牙填充物,可以刺激牙齿中干细胞的生长,从而修复受损的牙齿,使牙齿自愈。

牙医在治疗龋齿时,需要用牙钻去除牙齿龋坏的部分,并填充材料,修补缺损的牙体。但10%至15%的补牙会失败,需要进一步治疗牙髓,根管填充,严重时甚至需要拔牙。

美国哈佛大学和英国诺丁汉大学的研究人员研发出一种用合成生物材料制成的填充物,可以刺激牙髓中干细胞的生长,修复受损部位,使牙齿自愈。就像其他的常规填充物一样,这种生物材料需要注射进牙齿,并用紫外线照射来加快硬化过程。

研究人员发现,在体外实验中,这种填充物能刺激干细胞的增殖,并分化成牙本质。牙本质是构成牙齿主体的硬组织,主要功能是保护其内部的牙髓和支持其表面的牙釉质。

12.J Dent Res:颅骨锁骨发育不全患者牙髓细胞分化异常
doi:10.1177/0022034514566655

锁骨颅骨发育不全(CCD)是Runx2基因的杂合突变引起的骨骼发育不良,Runx2基因是骨和牙齿矿化必不可少的。我们从一个十岁的CCD患者中分离出原代牙髓细胞,测试它们的增殖能力、碱性磷酸酶活性、矿化结节的形成能力,并与从7例健康儿童分离出的牙髓细胞对比。测得CCD患者牙髓细胞的各项指标均低于健康对照者。

同时我们发现,CCD患者的原代牙髓细胞中,成骨细胞/成牙本质细胞相关基因RUNX2、ALP、OCN和DSPP 的表达也显著降低。与人外周血单核细胞共同培养的原代牙髓细胞中破骨细胞相关标志物TRAP、CTSK、CTR和MMP9的表达也有降低。此外,CCD患者牙髓细胞中RANKL的表达以及RANKL/OPG 的比例也降低了,这表明RUNX2的突变干扰了骨重建的过程,降低了原代牙髓细胞诱导破骨细胞分化的能力。这可能会造成牙齿发育不全以及乳牙滞留,而牙齿发育不全和乳牙滞留正是CCD典型的临床表现。

13.牙齿结缔干细胞可促进血管形成

近日,圣保罗州立大学牙科系进行的一项博士答辩宣称,人类牙齿结缔组织滋生的干细胞,有明显的促进血管形成和增生的作用。该项研究表明,在血液的低氧状态下,这些干细胞能够刺激外伤情况下负责血管再造的蛋白质的形成。

该项研究是在杰克斯·诺尔教授指导下,在美国密歇根大学的牙科实验室进行的。研究人员安德莱萨·玛利亚称,此项研究第一次显示,在缺氧状态下,牙齿内部结缔组织(牙髓结缔组织)的干细胞中出现这种分子现象,这与该结缔组织内其他种类的细胞在现有血管基础上增生新的血管的情形是不同的。她还称,这种机制将来可能会应用在因牙齿外伤而受到损伤的结缔组织的血管再造治疗,从而避免牙齿组织坏死或其他牙结构的损伤,目前试管实验结果有待于在临床上证实。

安德莱萨·玛利亚在研究中将牙内结缔组织细胞置入低氧状态,主要包括三部分组织:牙釉部分、外部结缔组织、内部结缔组织(牙髓结缔组织),即一般所称的牙“神经”,具有丰富的血管组织。实验的目的是检验干细胞和成纤维细胞促进血管和内皮细胞形成的能力。结果证实,人类牙髓结缔组织衍生的干细胞和成纤维细胞,具有在低氧状态下促进血管形成的功能。

14.日本科学家用乳牙干细胞制成肝细胞

2016年3月21日,新华社发布了日本关于乳牙干细胞的最新研究成果,日本研究人员称,他们利用从儿童乳牙中提取的干细胞培育出大量肝细胞,并通过移植这些细胞成功改善了肝硬化实验鼠的症状。 人在婴幼儿时期会逐渐长出20颗乳牙,随后陆续脱落,逐个由恒牙代替。近年来,乳牙干细胞作为一种应用前景广泛的干细胞受到越来越多关注,因为它们可以分化为骨骼细胞等多种细胞,甚至被认为比脐带血干细胞更为“奇特”。 日本九州大学研究人员在日前举行的日本再生医疗学会总会上报告说,他们在合法取得健康儿童的乳牙后,从乳牙牙髓中提取了干细胞,并添加促进干细胞分化的蛋白质进行培养,最终得到了大量肝细胞。他们将这些肝细胞移植到肝硬化实验鼠体内后,发现实验鼠的肝病症状得到了改善。 研究人员表示,乳牙干细胞来自脱落的乳牙,比其他干细胞更易获取,今后有望用于先天性肝功能异常等疾病的治疗。

15.干细胞研究新突破——乳牙干细胞

干细胞存在于乳牙中是一个相对新的发现,2003年儿科牙医石松涛在他6岁的女儿的乳牙中发现了干细胞。他提取并保存了这些细胞,随后研究人员便发现了乳牙干细胞的众多作用,比如它可以再生骨骼、心脏组织和软骨。最重要的是它含有间充质细胞,可以再生为很多种类的其它细胞。

目前,乳牙干细胞已被成功地用于修复脊髓损伤,并有望治疗一些退行性疾病,如阿尔茨海默症,帕金森症和其他一些神经系统疾病。

十年前,这些提取的干细胞会在瞬间被冻结,但现在储存的时候工作人员是逐降低温度的,直到零下196摄氏度。这些干细胞随后会被转移到主存储设备中,一般能保存30年左右。

在一个牙齿中只有几千个干细胞,如果有一天,可以用牙齿中提取的少量的干细胞来治疗成人白血病,那该有多少人免于一场灾难呀。目前干细胞在临床中发挥越来越大的作用,在今后的岁月里,希望它能像献血一样得到人们的普遍认同和参与。(生物谷 Bioon.com)

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