新功能、新界面、新体验,扫描即可下载生物谷APP!
首页 » 高分辨率成像 » 结构生物学研究进展一览

结构生物学研究进展一览

来源:本站原创 2017-09-25 19:27

2017年9月25日/生物谷BIOON/---本期为大家带来的是最近结构生物学领域的最新研究进展,希望读者朋友们能够喜欢。


DOI: 10.1038/ncomms14512



离子通道是一类调控钙、钠或钾离子在细胞膜两侧流动的蛋白。控制这些离子的流动对于维持机体的正常功能十分关键。负责编码离子通道蛋白的基因发生突变会影响很多疾病的发生,因此,为了理解这些突变是如何导致疾病的,研究者们需要对离子通道蛋白的三维结构进行深入的解析。

此前,来自犹他大学的DeCaen博士等人发现一类叫做PDK2的基因的突变会导致大型的肾脏多囊化以及肾脏功能衰竭等症状的出现,而且他们知道该基因负责编码一种离子通道蛋白,但该蛋白具体调控哪类离子的流动此前并不清楚。因此,研究者们将蛋白质放在极低的温度环境下,并且利用先进的电子显微镜技术拿到了蛋白的结构。相关结果于去年发表在《Cell》杂志上。

此外,来自药学系的副教授Murali Prakriya博士则对钙离子的通道蛋白CARC十分感兴趣。CARC是一类主要存在于免疫细胞膜上的离子通道,当通道打开时会允许钙离子的流入,从而激活下游基因的表达以及细胞的增殖。目前发现很多疾病与CARC的紊乱有关,其中包括免疫缺陷、肌肉营养失调以及神经性疾病等等。

在最近发表在《Nature Communications》杂志上的一篇文章中,Prakriya等人揭示了CARC通道的开启与关闭的细节。这项研究鉴定出了该离子通道在静止状态下以及开闭过程中的分子结构。

首先,科学家们利用电生理以及显微成像技术系统性的检测了CARC蛋白的不同结构与对于通道开启的作用。之后,通过计算机模拟的手段找到了氨基酸调控离子穿透的机制。

"在离子通道中,中间的空隙充斥着水分子。因此关闭这一空隙的方法是利用亲脂性的化学基团"组织水分子以及离子的浸入。而在打开通道的时候,疏水性的基团需要挪开以保证水分与离子能够进入。

这一发现具有十分重要的临床意义,人类中CARC基因的一些突变往往导致流血、神经紊乱以及肌肉乏力失控等现象,这往往是由于细胞中存在过量的钙离子。因此,这一发现有助于优化对上述疾病的治疗方案。



doi:10.1126/science.aao2825



在一项新的研究中,来自德国和荷兰的研究人员利用冷冻电镜技术、固态核磁共振光谱技术和X射线衍射技术,解析出有史以来分辨率最高的β淀粉样蛋白纤维(amyloid-beta fibril, Aβ蛋白纤维)结构。人体自身的Aβ蛋白纤维是与阿尔茨海默病相关联的大脑蛋白沉积物的主要组分。他们解析出的这种原子水平的三维结构揭示出这些有害堆积物生长的之前未知的方面和遗传风险因素的影响。相关研究结果于2017年9月7日在线发表在Science期刊上,论文标题为"Fibril structure of amyloid-?(1-42) by cryoelectron microscopy"。

这种结构揭示出很多个β淀粉样蛋白(Aβ)分子如何成层地交错排列在一起,形成所谓的原纤维(protofilament)。两个这样的原纤维彼此缠绕在一起,形成Aβ蛋白纤维。如果几个这样的Aβ蛋白纤维缠结在一起,它们就产生在阿尔茨海默病患者的大脑组织中检测到的特征性堆积物或者说斑块。

论文共同通信作者Dieter Willbold教授说,"这是获得对淀粉样蛋白结构和相关疾病的基础理解的里程碑成就。这种Aβ蛋白纤维结构解答了关于Aβ蛋白纤维生长机制的很多问题,而且鉴定出导致阿尔茨海默病早期发生的一系列家族性突变所发挥的作用。"

这种结构的分辨率为4埃(即0.4纳米),与原子半径和原子键长度属于同一个数量级。与之前的研究不同的是,这种结构首次展示出Aβ蛋白的精确位置和相互作用。因此,这些缠结在一起的原纤维中的Aβ蛋白分子并未不是处于相同的水平,而是像拉链那样,相隔半个间隔交错排列。再者,这种结构首次揭示出很多个Aβ蛋白分子中的所有42个氨基酸残基的位置和构象。

这种详细的结构为理解多种增加患上阿尔茨海默病风险的基因修饰的结构影响奠定基础。这些基因修饰通过在特定的位点上改变这种蛋白的蓝图,从而使得Aβ蛋白纤维稳定化。这也解释了为何在自然中,小鼠不会患上阿尔茨海默病,以及一小部分冰岛人群为何似乎更加容易或更加不容易患上这种疾病。他们的Aβ蛋白变异体分别相差三个或一个氨基酸残基,明显的是,这些残基在Aβ蛋白纤维的稳定性中发挥着重要的作用。



doi:10.1038/nature23484



在一项新的研究中,来自美国霍华德-休斯医学研究所(HHMI)的Axel Brunger和同事们通过可视化观察三种神经蛋白彼此间如何相互作用,揭示出它们如何协助成群的脑细胞同步释放化学信号。一种类似的相互作用可能也在细胞如何分泌胰岛素和气道粘液中发挥着作用。相关研究结果发表在2017年8月24日的Nature期刊上,论文标题为"The primed SNARE-complexin-synaptotagmin complex for neuronal exocytosis"。

这项研究描述了这三种蛋白之间的一种新的合作,并且为细胞分泌胰岛素和气道粘液等分子的其他过程提供新的认识。

当一群神经元接受到一种电信号,这些神经元在不到一千分之一秒的时间内几乎同时地释放被称作神经递质的化学物。神经元在被称作突触囊泡(synaptic vesicle)的气泡状结构中保持神经递质。这些结构位于指向邻近细胞的长又薄的神经突起的末端内。为了释放神经递质,神经元必须将突触囊泡与神经突起的外膜融合在一起。这就打开突触囊泡,将它们的内含物释放到细胞之间的间隙中。这些化学信号随后漂移到邻近细胞中,从而实现信息接力传递。

科学家们已知三种蛋白参与释放神经元中的化学信号。一组被称作SNARE的蛋白为膜融合提供能量。当接触一种电信号之后,钙离子出现时,另一种被称作突触结合蛋白(synaptotagmin)的蛋白释放神经递质。第三种被称作complexin的蛋白阻止细胞自动地释放神经递质。突触结合蛋白和complexin都与SNARE蛋白相互作用,但是在此之前,科学家们不能够解释这三种蛋白如何在一起发挥作用。

在这项新的研究中,Brunger团队合成出这三种蛋白中的每种蛋白的部分片段,允许它们组装成一种复合体,并且诱导这种复合体形成晶体。他们随后利用X射线晶体衍射技术,解析出这种复合体的结构。

这种晶体结构揭示出这些蛋白相互作用的两种方式。突触结合蛋白和SNARE蛋白之间的第一种相互作用与Brunger和同事们在2015年发表在Nature期刊上的一篇论文(Nature, 2015, doi:10.1038/nature14975)中描述的完全一样。第二种意料之外的相互作用揭示出在这种复合体中的三种组分之间存在关联。

在这种三组分相互作用中,complexin蛋白的一个卷曲螺旋位于突触结合蛋白的一个螺旋附近,这种布置使得这些螺旋像螺钉的螺纹那样对齐。这些螺旋也位于SNARE蛋白的螺旋的顶端。

通过与HHMI研究员Thomas Südhof合作,这些研究人员对小鼠神经元进行改造,从而产生突变的突触结合蛋白,这种突变会削弱这三种蛋白之间的相互作用。携带着突变蛋白的神经元,或者缺乏complexin蛋白的神经元,不能够同步释放神经递质。

基于这些观察结果,这些研究人员提出这种三组分相互作用锁住SNARE蛋白,因此除非到了合适的时刻,它们不能够执行神经递质释放所必需的膜融合。complexin蛋白将这三种蛋白别在一起,而且当遭受钙离子触发时,突触结合蛋白可能解除对SNARE蛋白的锁定。

Brunger说,"这种三组分相互作用直观地解释了这三种组分的作用。如今,我们能够解释complexin蛋白、突触结合蛋白和SNARE蛋白之间的合作。"

哺乳动物细胞存在着60多种不同的SNARE蛋白,而且这些SNARE蛋白与多种形式的突触结合蛋白一起参与激素释放和其他的细胞过程。Brunger说,一种类似的涉及SNARE蛋白的三组分相互作用可能也被用于其他的钙离子依赖性的细胞释放过程中。



doi:10.1038/nature23903



在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员利用冷冻电镜技术(cryo-EM)解析出分辨率为4.4埃或者说近原子分辨率的一种被称作人转录因子IIH(transcription factor IIH, TFIIH)的蛋白复合物的三维结构。这种蛋白复合体被用来解开DNA双螺旋从而使得在转录或修复期间,基因能够被接触到和读取。相关研究结果于2017年9月13日在线发表在Nature期刊上,论文标题为"The cryo-electron microscopy structure of human transcription factor IIH"。

论文通信作者、劳伦斯伯克利国家实验室分子生物物理学与集成成像部门研究员Eva Nogales说,"当TFIIH发生差错时,DNA修复就不能够发生,而且这种功能故障与严重的癌症倾向性、过早老化和多种其他的缺陷相关联。利用这种结构,我们如今能够开始将突变考虑在内,以便更好地理解为何它们导致细胞产生异常的行为。"

TFIIH在DNA功能中发挥的至关重要的作用使得它成为一种主要的研究靶标,但是它被认为一种很难研究的蛋白复合物,特别在人类中。

Nogales说,"随着有机体变得更加复杂,这些蛋白也是如此,在多种不同的水平上获得调节功能所需的额外片段。我们解析出来自人细胞的这种蛋白复合物结构的事实使得它与疾病研究更加相关。没有必要基于这种蛋白复合物在其他有机体中如何发挥作用来推断它在人体中的功能。"



doi:10.1038/nature24268



在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校、麻省总医院、哈佛医学院和劳伦斯伯克利国家实验室的研究人员鉴定出Cas9蛋白中的一个关键区域决定着CRISPR-Cas9如何精准地对靶DNA序列进行编辑,对它进行微调可产生超精准的基因编辑器,并且使得该基因编辑器的脱靶切割(off-target cutting)活性降低到有史以来的最低水平。相关研究结果于2017年9月20日在线发表在Nature期刊上,论文标题为"Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy"。论文通信作者为加州大学伯克利分校分子与细胞生物学教授、霍华德-休斯医学研究所研究员Jennifer Doudna博士。

在CRISPR-Cas9中,Cas9蛋白起着结合和切割DNA的作用。这些研究人员说,他们鉴定出的这种蛋白区域作为DNA切割的一种主控制器发挥作用,是对Cas9进行重新设计进一步提高它的切割精准度的一种显而易见的靶标。这种方法应当有助科学家们定制设计Cas9变异体,从而使得CRISPR-Cas9在错误位点上对DNA进行编辑的几率最小化。当利用CRISPR-Cas9在人体进行基因治疗时,这是一个关键的考虑因素。

一种提高精准度的策略是在这种控制性的被称作REC3的蛋白结构域中引入突变,然后观察哪些突变会提高精准度,同时不会影响在靶切割(on-target cutting)的效率。

论文共同第一作者、Doudna实验室研究生Janice Chen说,"我们发现即便Cas9的REC3结构域发生微小的变化也会影响在靶编辑和脱靶编辑之间的差异,这提示着这个结构域明显是通过深入地诱发突变来改善靶向特异性的候选者。作为这项研究的延伸,相比于我们之前开展的靶向突变,我们能够在REC3结构域中更加无偏向性地引入突发。"其他的论文共同第一作者为加州大学伯克利分校的Yavuz Dagdas和哈佛医学院的Benjamin Kleinstiver。

超精准的Cas9

2012年,Doudna和德国马克斯-普朗克感染生物学研究所的Emmanuelle Charpentier将Cas9蛋白改作他用,构建出一种便宜的、廉价的和易于使用的基因编辑器。从那以后,人们就已寻求降低脱靶编辑的几率。尽管改进的保真度有利于开展基础研究,但是当将基因编辑用于临床应用时,这是至关重要的,这是因为任何脱靶DNA切割可能让关键基因丧失功能,从而导致永久性的和意想不到的副作用。

在过去的两年里,两个研究团队构建出高度精准的Cas9蛋白:一种特异性增强的Cas9,即eSpCas9(1.1);一种高保真度的Cas9蛋白,即SpCas9-HF1,而且Chen和Doudna试图了解为何它们要比如今广泛使用的来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的野生型Cas9蛋白更高特异性地切割。

当前,使用CRISPR-Cas9的科学家们构建出单向导RNA(sgRNA)---一种RNA分子,含有长20个核苷酸的RNA片段,而且该片段与想要靶向的长20个核苷酸的特定DNA序列互补---并且将它附着到Cas9上。这种sgRNA允许Cas9蛋白靶向互补的DNA序列,结合并切割它。但是这种Cas9-sgRNA复合物也能够结合到不那么精确匹配的DNA上,从而导致不想要的脱靶切割。

2015年,Doudna实验室发现了Cas9的一种构象开关,当sgRNA与靶DNA匹配时,这种构象开关会被激活(Science, doi:10.1126/science.aac6572; Nature, doi: doi:10.1038/nature15544)。他们已发现仅当这种sgRNA与靶DNA严格匹配时,Cas9的三维结构,特别是它的HNH核酸酶结构域构象,会发生改变,从而激活Cas9的切割活性。然而,负责识别这种构象开关上游的这些核酸的过程仍然是不为人知的。

在当前的这项研究中,Chen和Dagdas利用一种被称作单分子荧光共振能量转移(single-molecule FRET, smFRET)的技术准确地测量当Cas9-sgRNA复合物结合到靶DNA上时,这种复合物中的多种蛋白结构域,特别是REC3、REC2和HNH结构域,如何移动。

他们首先确定了eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1提供的特异性益处能够根据这些Cas9变体中的HNH构象开关的激活阈值要比野生型Cas9蛋白高得多从而使得当结合到脱靶序列上时eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1变体更不可能激活Cas9的切割活性的事实加以解释。

接着,他们发现REC3结构域负责检测靶标结合的精准度,随后这会指示REC2结构域向外旋转而为HNH核酸酶结构域打开一条通路,从而激活Cas9的切割活性。具有这种活性构象的Cas9随后能够切割靶DNA的双链。 

Chen、Dagdas和Kleinstiver随后证实通过让REC3的部分片段发生突变,就有可能改变Cas9蛋白的特异性,使得HNH核酸酶结构域不会被激活,除非这种sgRNA与靶DNA非常严格地匹配。他们能够设计出一种改进的超精准的Cas9(被称作HypaCas9),这种HypaCas9保留了它的在靶切割效率,但略微更好地区分人细胞中的在靶位点和脱靶位点。

Chen说,"如果让REC3中的某些氨基酸残基发生突变,那么人们就能够调整Cas9的在靶切割活性和改进的特异性之间的平衡;我们能够找到这样的一个甜美的平衡点,从而确保在预定的靶标上具有足够的切割活性,同时大幅降低脱靶事件。"

通过继续探究Cas9的结构、功能和动力学之间的关系,Doudna和她的团队希望能够进一步地对这种蛋白进行高度灵敏地改造,从而利用它可靠地和高效地产生多种遗传变化。(生物谷 Bioon.com)

版权声明:本文系生物谷原创编译整理,未经本网站授权不得转载和使用。如需获取授权,请点击
温馨提示:87%用户都在生物谷APP上阅读,扫描立刻下载! 天天精彩!


...(全文约10028字)
显示全文...
<< 去看24小时最新(57)

相关标签

最新会议 培训班 期刊库