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CRISPR/Cas9技术促进农业发展

来源:本站原创 2017-09-20 08:23

2017年9月20日/生物谷BIOON/---本期为大家带来的是CRISPR/CAS9技术在农业发展方面的应用潜力与最新研究进展,希望读者朋友们能够喜欢!




doi:10.1016/j.cell.2017.08.030



在一项新的研究中,来自美国冷泉港实验室(CSHL)和马萨诸塞大学阿默斯特分校的研究人员利用基因组编辑的仍然未充分开启的力量改善农作物。以西红柿为例,他们利用CRISPR/Cas9技术快速地产生这种植物的变异株,这些植物变异株广泛地、持续地表现出三种独立的农业上重要的性状:果实大小、分枝结构(branching architecture)和整体植物形状。它们都是决定着植物产量的主要因素。这种方法适用于所有的食物作物、饲料作物和燃料作用,包括水稻、玉米、高粱和小麦。相关研究结果于2017年9月14日在线发表在Cell期刊上,论文标题为"Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing"。

论文通信作者、CSHL教授Zachary Lippman说,"随着人口的增加,当前的作物增产率并不能满足地球的未来农业需求。最严重的限制之一是大自然并没有给育种者提供足够多的遗传变异用于研究,特别是针对主要的能够涉及几十种基因的产量性状。我们的实验室如今利用CRISPR技术产生新的遗传变异,这能够加快作物改良,同时让它的结果更可预测。"

这些实验涉及利用CRISPR/Cas9"剪刀"在西红柿的三个被称作启动子的基因组序列上进行多次切割,其中启动子是相关基因附近的调节性DNA区域,有助调节这些"产量"基因在生长期间在何时、何处和在多大的水平上是有活性的。这些研究人员以这种方式在每个调节性区域中产生多组突变,从而能够诱导这三种目标性状中的每一种发生广泛的变化。

Lippman解释道,"我们利用每种性状证实利用CRISPR/Cas9能够产生新的遗传变异和性状变异,从而能够让育种者根据情况对植物进行量身定做。如今每种性状能够以一种调光开关控制灯泡的方式加以控制。"

通过利用CRISPR/Cas9让调节序列(即相关"产量"基因的启动子而不是这些基因本身)发生突变,这些研究人员发现他们能够实现对数量性状(quantitative traits)的更加微小的影响。鉴于这些遗传变异为改善产量性状提供的灵活性,微调基因表达而不是剔除或灭活它们编码的蛋白最可能有利于农业商业化。

Lippman说,"传统育种涉及花费大量的时间和精力来将相关基因的有益变异转变为最佳的品种,而且必须每年持续地改良这些品种。我们的方法在有利于育种的其他的自然突变环境下直接产生和选择控制基因活性的最理想变异体,从而有助于绕过这种限制。我们如今能够利用天然的DNA开展研究,增强大自然提供的选择力量,我们认为这能够有助于打破产量限制。"

每个突变区域都会产生数量性状位点(quantitative trait loci, QTL)。在任何一种给定的植物中,QTL都是在上千年的进化中自然产生的,结果就是自发性突变导致产量性状产生微小变化。几个世纪以来,寻找和使用大自然提供的QTL一直是植物育种者的目标,但是最有价值的QTL,即导致性状产生微小变化的那些QTL,是比较罕见的。Lippman和他的团队如今证实能够将CRISPR产生的QTL与现存的QTL结合起来,产生遗传变异的"工具箱",而且这些遗传变异的数量超过自然界中发现的数量。



doi:10.1038/s41598-017-10715-1



最近,科学家们通过CRISPR基因编辑技术成功地改变了一种日本花园花卉的颜色,这一突破证明CRISPR技术在更广泛的领域内具有潜在的利用价值。

这一被改造的花卉叫做日本牵牛花,研究者们仅仅改变其其中一个负责花瓣颜色的基因。然而这一研究却表明CRISPR技术的应用价值远不止于此。

如果你还不熟悉CRISPR/CAS9技术,那么简单来说,该技术的原理是实现DNA的定点切割与编辑,从而实现生物学领域更深层次的工程化目的。虽然很多人关心该技术是否会存在滥用的情况,但事实已经证明它能够为人们的研究与生活提供很大的便利。如今我们已经将其应用于动物疾病的治疗,不过对于未来能否适用于人体,很多伦理方面的声音仍不绝于耳。

如今,来自日本的科学家们称该技术能够为植物的工程化培育提供同样巨大的帮助。"据我们所知,这是第一次利用CRISPR技术进行植物花瓣颜色编辑的试验",研究者们说道。

在这一研究中,作者靶向了牵牛花中一个负责花瓣颜色的基因"DFR-B",该基因编码的酶能够负责催化色素的产生,其活性的丧失会导致花瓣颜色变白。实验结果表明,有75%接受处理的植物胚胎发育成熟后开出了白色的花朵,此外,该基因附近的其它基因并没有受到干扰。

"这一试验的成功将促进未来该技术应用于花瓣颜色的编辑"研究者们总结道。相关结果发表在最近一期的《Scientific Reports》杂志上。



,doi:10.1126/science.aan4187



作为一家专注于将异种移植转化为一种拯救生命的医疗手段的生物技术公司,eGenesis公司宣布该公司的科学家们和他们的合作者们在一项新的研究中证实利用CRISPR/Cas9让猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retroviruses, PERV)失活可阻止跨物种病毒传播,从而使得他们在成功地培育首批不含PERV的猪方面取得突破。这也是异种移植的一个重要的里程牌。相关研究结果于2017年8月10日在线发表在Science期刊上,论文标题为"Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9"。

异种移植涉及将动物器官移植到人体中,是一种有前景的方法,有助缓解用于人体移植的严重器官短缺。然而迄今为止,PERV的跨物种传播风险和其他的问题阻碍着它在人体中的使用。eGenesis公司致力于利用CRISPR技术提供安全而又有效的在猪体内培养的可移植人细胞、组织和器官,以便解决全世界几十万名患者的迫切需求。

论文通信作者、eGenesis公司首席科学家杨璐菡(Luhan Yang)博士说,"这是首次报道培育不含PREV的猪。我们开发出一种能够开展多重基因组编辑的方法:利用CRISPR技术在可克隆的猪原代成纤维细胞中根除所有的PERV活性,成功地产生不含PERV的猪品种。这项研究代表着在解决跨物种病毒传播的安全问题上取得重大进展。我们的团队将进一步培育不含PERV的猪品系,以便开展安全而又有效的异种移植。"

在这项新的研究中,这些研究人员研究了PERV传染风险,并且在体外证实PERV感染人细胞,而且可传播到之前从未与猪细胞相接触的人细胞中。这就需要解决这个问题以便确保安全的异种移植。

这些研究人员利用CRISPR-Cas9技术能够高效地和精准地在原代成纤维细胞中进行基因组编辑。在与一种在多重基因组编辑期间抑制原代细胞死亡的方法相结合的情形下,他们利用经过基因改造的原代细胞和体细胞核转移技术,成功地培育出有活力的不含PERV的猪胚胎。他们随后将这些不含PERV的猪胚胎移植到代孕母猪中,结果证实起初在猪胎儿中,最终在近期出生的小猪中,未发生PERV再次感染。这些小猪是首批出生时不含有PERV的动物,而且eGenesis公司将监控这种处理对这些小猪的长期影响。

eGenesis公司在培育出首批不含活性的PERV的小猪之后,正在努力将不含PERV的猪的安全益处与进一步的基因编辑结合起来,以便解决异种移植时的免疫反应问题,从而增加器官免疫和功能上的相容性。



doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.032



从它们硕大的果实以及紧密的枝干来看,西红柿的确是几千年人为培育的成果。然而,许多单独看来很有生产价值的性状背后的基因突变结合在一起反而会产生不如人意的结果。

来自冷泉港的遗传学家Zachary Lippman与同事们在鉴定出了这些有意思的基因突变之后,希望利用CRISPR基因编辑技术对西红柿进行改造,以提高其适应环境的能力以及产量。

"这听上去很诱人",来自亚利桑那大学的植物遗传学家Rod Wing说道:"这一技术不仅仅可以用于改造西红柿,还能够用于所有作物的改良"。

腐烂的西红柿

Lippman从小对西红柿田地十分熟悉,在青少年时期,他就经常徒手摘西红柿,但他却不喜欢这个农活。"腐烂的西红柿发出的气味能够持续一整天。因此我总是盼望摘西红柿那天天会下雨"。

然而多年以后,他对于控制植物性状背后的遗传学原理的兴趣却使得自己重新回到了西红柿田中,试图寻找播种者们无意中引发的遗传变异。

1950年,研究者们在加拉帕戈斯群岛上发现了一种类似于西红柿的野生植物,该植物并没有肿胀的,被称为"节"的茎部。

节是植物的茎中最脆弱的部分,果实也因此容易掉落在地上。野生的植物依靠这一手段进行种子的传播,但对于采摘果实的农民来说可就变成了难题。因此,当时培育者们就将这一植物的性状整合入了当时的西红柿品种中,成为了无关节的西红柿。

这一新的性状随后带来了问题:当整合进入现有的西红柿品种中后,植物的开花枝长出了很多小的分支,就像一个扫帚一样。这些花消耗了植物太多的养分,导致果实产量的下降。为了解决这一问题,培育者们试图寻找其它遗传变异的植株并用于改变这一缺点。几十年后,Lippman研究组则成功地发现了该现象背后的遗传学机制。

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他们此前筛选了4193中不同的西红柿品种,试图找到与分支有关的类型。在这一筛选中,他们找到了两类基因。这两种基因合起来导致了分枝的过度形成,其中一个就负责关节的退化。相关结果发表在最近一期的《Cell》杂志上。

另外一个基因则是负责果实上方伞盖状叶子的形成。该性状的具体作用目前并不清楚,但研究者们认为可能与果实的增重有关。

在找到了这些基因之后,研究者们利用CRISPR基因编辑技术抑制了它们的功能。除了这两个基因之外,另外一个负责开花数量的基因也接受了改造。在众多的改造的排列组合中,作者发现其中有一部分品种的产量得到了增加。

这些发现能够帮助植物培育者们充分考虑雨中之后可能出现的负面效应,从而更加合理地设计育种方案。如今,他们正在与培育者们合作利用基因编辑技术改良西红柿的分支、花的数量以及果实的大小。"我们十分希望能够将基础科学知识应用于农业"。Lippman博士说道。



doi:10.1016/j.tplants.2017.01.004.



在存在的30多万种植物物种中,仅三种物种---水稻、小麦和玉米---占据着人们消费的大多数植物食物,这部分上是因为在农业历史上,让这些农作物最容易收割的突变产生了。但是来自丹麦哥本哈根大学的研究人员声称利用CRISPR技术,人们不必等待大自然协助植物驯化。在于2017年3月2日在线发表在Trends in Plant Science期刊上的一篇综述论文中,他们描述了基因编辑如何可能能够让有营养的可持续种植的野生豆科植物、藜麦或苋属植物更适合种植。这篇综述论文的标题为"Accelerating the Domestication of New Crops: Feasibility and approaches"。

论文通信作者、哥本哈根大学植物学家Michael Palmgren说,"在理论上,你如今能够获得这些在几千年农作物驯化中挑选出来的性状,如苦味下降和那些促进容易收割的性状,并且诱导从不能栽培的植物发生具有这些性状的突变。"Palmgren领导哥本哈根大学的一个被称作"植物改变世界"的跨学科智库。

利用不那么精确的基因编辑技术,这种方法已被成功地用于加快驯化被低估的农作物。比如,科学家们利用化学突变诱导垂枝的水稻植物发生随机突变,从而使得它在成熟后更可能紧紧抓住它的种子。这种垂枝的水稻植物是一种与驯化水稻存在亲缘关系的澳大利亚野生水稻物种。在野外的一种被称作水芹的杂草中,科学家们利用RNA干扰沉默参与脂肪酸合成的基因,从而导致种子油质量改善。

Palmgren说,"我们如今吃的所有植物都是突变体,但是这些农作物是人类经过几千年挑选出来的,而且它们的突变是随机产生的。利用基因编辑,我们能够培育出'生物启发的有机体(biologically inspired organisms)',即我们不想要改进大自然,我们想要从大自然已制造出的东西中获得启发培育出所需的有机体。"

这种策略也有潜力解决与杀虫剂使用和大规模农业生产对环境的影响相关的问题。比如,在化肥中,过量氮元素的流失部分是一种常见的污染物;然而,野生豆科植物通过与细菌共生,能够将大气中获得的氮气转化为它们自己的肥料。Palmgren说,"为何不试着驯化更多的这些植物呢?"

在加快植物驯化时,只要涉及对农作物进行基因编辑,就可能产生类似的伦理问题、经济问题和法律问题。然而,公众意见在一定程度上可能存在差异,这是因为这种方法并不从另一种有机体中获得基因,而是剔除现存的基因。对农民和培育者而言,添加未被充分利用的植物品种可能不会立即产生吸引力,这是因为不存在那么大的需求,而且让消费者偏好它们的努力将是必不可少的。然而,实现这种转变的公共物品可能最终是一个卖点。

Palmgren团队在两年前发表一篇相关的论文,在这篇论文中,他们利用基因编辑让驯化植物更加"野生化"因而让有机种植的农民更难种植(Trends in Plant Science, July 2015, doi:10.1016/j.tplants.2015.04.011)。他们希望随着农业不断地满足不断增加的需求,他们能够让公众和政策制定者准备好将基因组编辑用于我们的食物供应中。



doi:10.1371/journal.ppat.1006206.



在一项新的研究中,来自英国爱丁堡大学、皮尔布赖特研究所和Genus公司(Genus plc)的研究人员培育出基因编辑猪。这些猪可能免受一种每年导致养猪业损失数十亿欧元的病毒感染。相关研究结果于2017年2月23日发表在PLoS Pathogens期刊上,论文标题为"Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function"。

这些基因编辑猪是这些研究人员利用先进的基因编辑技术培育出的。它们潜在地抵抗猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)。PRRS是由一种病毒导致的,因此,该病毒被称作为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus, PRRSV)。

初步的测试结果揭示出来自这些基因编辑猪的细胞完全抵抗导致这种疾病的两种主要的PRRSV基因型感染。

这些研究人员说,这些猪在其他方面都是健康的,而且利用基因编辑技术在它们体内导入的变化应当不会影响它们抵抗其他感染的能力。

PRRS导致幼猪出现严重的呼吸问题,导致怀孕的雌猪繁殖失败。

已有研究证实PRRSV靶向被称作为巨噬细胞的免疫细胞。这些细胞表面上的CD163分子在能够让PRRSV建立感染中发挥着关键性的作用。

这些研究人员利用基因编辑工具CRISPR/Cas9切除猪DNA中的CD163基因的一小部分。

利用来自这些CD163基因发生修饰的基因编辑猪的细胞开展实验室测试,结果证实这些猪的DNA发生的变化阻断PRRSV的感染能力。

这项研究的下一个阶段将是测试当这些基因编辑猪接触PRRSV时,它们是否抵抗PRRSV感染。

另一个研究团队在之前的研究中培育出完全不产生CD163分子的猪,而且当这些猪接触PRRSV时,它们不会患病。

在这项新的研究中,CD163中仅与PRRSV相互作用的部分被移除,因而这种分子似乎保持它的其他功能。

在全世界的大多数养猪的国家中,PRRS是地方性流行病。疫苗大多数不会阻止PRRSV扩散,而且这种病毒持续快速地发生进化。因此,如今,它是养猪者面临的最大挑战之一。单就欧洲而言,据估计,这种疾病每年导致养猪业损失15亿多欧元。

论文通信作者、爱丁堡大学罗斯林研究所的Alan Archibald教授说,"这种基因组编辑技术通过降低因传染病造成的浪费和损失有助提高食品安全性,而且还通过降低疾病负担有助提高动物福利。我们的结果让我们在朝实现这些益处和专门解决全世界养猪业这个最为重要的传染病问题的目标上更接近一步。"

Genus公司首席科学家Jonathan Lightner说,"这些结果进一步展示了CD163在阻止PRRSV感染中的至关重要性,而且证实靶向移除CD163中的病毒相互作用结构域能够导致抵抗性产生,与此同时,这种蛋白的其余部分仍然保持存在。当Genus公司加快开发基因编辑技术来产生PRRSV抵抗性时,这种针对CD163基因的编辑,和针对其他基因的编辑将会接受评估。Genus公司致力于开创性地将这种技术应用于动物遗传改良中以便改善动物的健康、农户的生存状态和为不断增加的全球人口可持续地生产食物。"



doi:10.1038/ncomms14406.



在一项新的研究中,来自韩国基础科学研究所(Institute for Basic Science, IBS)基因组工程中心的研究人员利用新的CRISPR-Cpf1技术成功地对改变大豆油中的脂肪含量的两个基因进行编辑。CRISPR-Cpf1是一种更为广泛使用的基因编辑工具CRISPR-Cas9的替代性方法。这种新的植物基因编辑方法对大豆和野生烟草基因进行编辑取得的结果于2017年2月16日在线发表在Nature Communications期刊上,论文标题为"CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing"。

CRISPR-Cas9是第三代基因编辑系统,已被广泛地用于全世界的生物学实验室中。它由酶Cas9和CRISPR-RNA(crRNA)组成。Cas9发挥着一种"基因剪刀"的作用。crRNA引导这种"基因剪刀"在合适的位点对DNA进行编辑。

在此之前,IBS研究人员利用Cas9的替代物Cpf1对人细胞中的DNA进行编辑。这次,他们努力对植物基因进行编辑,成功地将CRISPR-Cpf1复合物导入到植物细胞中。

IBS研究人员设计CRISPR-Cpf1复合物对大豆中的两个FAD2基因进行切割。这两个基因是将油酸(一种脂肪酸)转化多不饱和亚油酸(另一种脂肪酸)的通路的一部分。通过让这两个FAD2基因发生突变,大豆种子中的油酸比例增加了,这导致更加健康的脂肪含量产生。

IBS研究人员也证实CRISPR-Cpf1并不能够切割大豆基因组中的非靶标位点。这些结果证实CRISPR-Cpf1是一种高度有效的技术。再者,这种方法是100%的不含有DNA(DNA-free)。它通过化学合成crRNA而无需导入外源DNA。这消除了外源DNA(用作RNA合成的模板)残留的风险。

IBS研究人员也发现相比于CRISPR-Cas9,CRISPR-Cpf1具有至少三种益处:CRISPR-Cpf1技术具有更短的crRNA,因此能够化学合成这种RNA;CRISPR-Cpf1在靶基因上产生更大的序列删除(7个碱基对),因而让这种基因完全失去作用;Cpf1的切割类型可能有助优化基因编辑过程。

KIM Jin-Soo教授解释道,"CRISPR-Cpf1可能被用作一种新工具来开发有附加值的作物,比如一种新的大豆品种,具有下降的不饱和脂肪含量。"



doi:10.1186/s13059-016-1144-4



在一项新的研究中,来自中国西北农林科技大学动物医学院的研究人员首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功地培育出具有增加抵抗牛结核病能力的奶牛。相关研究结果于2017年2月1日发表在Genome Biology期刊上,论文标题为"Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced off-target effects"。

研究人员利用一种改进的CRISPR基因编辑技术将一种新的基因插入到奶牛基因组中,而且在奶牛基因组中没有检测到脱靶效应。当利用CRISPR构建转基因动物时,脱靶效应是一个常见的问题。

论文通信作者、西北农林科技大学动物医学院教授、博导张涌(Yong Zhang)博士说,"我们利用一种新的被称作CRISPR/Cas9n的CRISPR系统将结核抗性基因NRAMP1成功地插入到奶牛基因组中。我们随后能够成功地培育出具有增加抵抗结核病能力的奶牛。重要的是,我们发现这不会在奶牛基因组中产生脱靶效应,这意味着我们采用的这种CRISPR技术可能更好地适用于产生转基因家畜。"

鉴于CRISPR技术是一种准确地和相对容易地修饰遗传密码的方法,近年来,它已广泛地用于实验室中。然而,遗传密码的意外变化会因脱靶效应而发生,因此发现降低这些意外变化的方法是基因组学研究的首要任务。

张博士解释道,"当你想要将一种新的基因插入到哺乳动物基因组中时,很难在基因组中找到最佳的位点来插入这种基因。你不得不找遍整个基因组,寻找一个你认为将对附近的其他基因产生最小影响的区域。我们利用一种细致的方法鉴定出最适合于基因插入的区域,而且我们证实这不会在奶牛基因组中产生可检测到的脱靶效应。"

研究人员利用CRISPR/Cas9n技术将NRAMP1基因插入到来自雌性奶牛的牛胎儿成纤维细胞基因组中。随后,这些细胞在一种被称作体细胞核移植的过程中用作供体细胞。在这种体细胞核移植中,将来自携带这种新基因的供体细胞的细胞核导入到来自雌性奶牛的卵细胞中。他们在实验室中培养这些卵细胞,随后将它们转移到具有正常妊娠周期的母奶牛体内。作为对比,也利用标准的CRISPR/Cas9技术开展这些实验。

利用CRISPR技术培育出总共11只携带这种新基因的小奶牛,它们能够接受结核病抵抗性和脱靶效应评估。对这些小奶牛的基因分析结果揭示出已将NRAMP1基因成功地插入到所有小奶牛的基因组靶位点上。在利用这种新的CRISPR/Cas9n技术成功地插入NRAMP1基因的小奶牛中,没有一只小奶牛具有任何可检测到的脱靶效应,而之前利用CRISPR/Cas9技术成功地插入NRAMP1基因的小奶牛中,所有的小奶牛都存在脱靶效应。

当这些小奶牛接触牛结核分枝杆菌(导致牛结核病的细菌)时,研究人员通过测量血液样品中标准的感染标志物,发现这些转基因小奶牛表现出增加的牛结核病抵抗性。他们也发现从这些小奶牛中提取出的白细胞在实验室测试中更加抵抗牛结核分枝杆菌感染。

张博士说,"我们的研究首次证实这种CRISP/Cas9n系统能够被用来构建没有可检测到的脱靶效应的转基因家畜。我们的研究已在牛基因组中发现一个有用的位点,利用这种基因编辑技术靶向这个位点可成功地插入有益于家畜的新基因。"(生物谷 Bioon.com)

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