新功能、新界面、新体验,扫描即可下载生物谷APP!
首页 » 干细胞&iPS » 单碱基替换重塑超级干细胞:访生物物理所博士研究生杨济平

单碱基替换重塑超级干细胞:访生物物理所博士研究生杨济平

来源:生物谷 2017-07-09 12:05

干细胞移植治疗可以通过替换病变、衰老的成体细胞,达到恢复组织器官稳态和功能的目的。这一技术在再生医学领域具有巨大的潜力,然而由于有效性和安全性两大问题,该技术的广泛应用仍然受到限制。近年来,科学家们从改善移植物活力、调控移植微环境以及制备辅助支架材料等方面进行着种种尝试,试图突破这两大再生医学领域亟待解决的难题。

7月7日,Cell Research杂志在线发表了中科院生物物理所刘光慧课题组、北京大学汤富酬课题组和中科院动物所曲静课题组合作的题为“Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recoding”的研究成果。该研究利用基因编辑技术改写了人类基因组遗传密码中NRF2编码基因第2号外显子上的单个碱基,首次在实验室中获得了遗传增强的“超级”干细胞(Genetically Enhanced Stem cells,GES细胞)。这种GES细胞具有对细胞衰老和致瘤性转化的双重抵抗作用,因此为开展安全有效的干细胞治疗提供了可能的解决方案。

该研究在刘光慧研究员、汤富酬研究员和曲静研究员的共同指导下,主要由生物物理所博士研究生杨济平和北京大学博士研究生李静宜合作完成。为此生物谷专访了研究的第一作者杨济平,请他就该研究中的一些热点问题进行了解答。

访谈内容:

(1)利用基因编辑产生GES的研究在国际上的研究进展如何?

杨济平:目前,国际上尚无在人类干细胞中进行遗传增强操作以提高其细胞活力和抑瘤能力的报道。但在许多研究中基因编辑已经展现出巨大的潜力。例如,中科院遗传与发育生物学研究所和中科院微生物研究所的研究人员利用基因编辑技术靶向突变了抗白粉病相关基因,获得了改良的抗病小麦。美国学者利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除了多酚氧化酶,获得了不易褐变的蘑菇。在人的造血干细胞中敲除趋化因子受体CCR5基因可以抵抗HIV病毒的感染,世界首例艾滋病的功能性治愈也已见诸报端。

(2)是如何想到利用基因编辑技术产生“遗传增强”这一策略的?

杨济平:我们实验室自2011年以来一直从事着利用基因编辑进行靶向基因矫正(gene correction)的研究,目前成功矫正的遗传疾病包括儿童早衰症、镰刀型细胞贫血症、范可尼贫血症、帕金森氏病及脊髓侧索硬化症等。此外,我们实验室也利用靶向敲入(knock-in)技术创建了帕金森氏病和范可尼贫血症等人类疾病的干细胞研究体系。我们也利用基因敲除技术研究了WRN,PTEN和SIRT6等蛋白的loss of function对人类干细胞的影响。

自基因编辑工具问世以来,人们曾有过遗传增强的幻想,包括学术界一直反对的“在生殖细胞或早期胚胎中进行基因编辑设计完美婴儿”,但这在伦理上是受到禁止的。我们实验室在2012年提出在体外培养的人类干细胞中通过基因编辑技术进行遗传增强的假设,最初的构思就是通过基因编辑技术抵抗应激和衰老以及抵抗癌变两个方面,目标是获得更安全有效的干细胞移植物。

(3)这个项目做了多久?

杨济平:自我进实验室起,实验室就已开展这个课题,目前已经进行了5年。

(4)为何选择NRF2这一靶标,利用其产生GES细胞的原理是什么?

杨济平:NRF2是进化保守的具有细胞保护功能的转录因子,调控着一系列细胞保护基因的表达。在低等生物如线虫果蝇中,NRF2同源蛋白的缺失会导致个体寿命的缩短,而NRF2同源蛋白的过表达则有延寿的效果。2016年我们实验室发表在Cell上的论文显示,儿童早衰病人的成纤维细胞和间充质干细胞中NRF2的功能抑制是导致细胞加速衰老的重要原因,而激活NRF2可以显著的缓解早衰表型。另一方面,NRF2在抑制正常细胞发生恶性转化方面发挥着关键作用。比如,许多预防癌症的药物(包括植物化合物)的作用都是通过激活NRF2实现的。已有研究表明,NRF2的缺失会使致癌物诱导的肿瘤更易发生。以上这些均提示激活NRF2可能是同时实现细胞抵抗压力和衰老以及细胞恶性转化的有效方案。我们激活内源NRF2的策略是在NRF2基因组的编码区替换了一个核苷酸(A245G),使得NRF2蛋白的第82号氨基酸由谷氨酸变换为甘氨酸。这单氨基酸改变削弱了NRF2与其抑制蛋白KEAP1的相互作用,导致NRF2蛋白的稳定性提高,更多的NRF2得以进入细胞核中并加强下游细胞保护基因的转录。

(5)编辑NRF2基因是否会对所有人类细胞类型产生遗传增强的效应?

杨济平:我们利用的遗传增强策略的原理之一是通过激活内源NRF2提高细胞的抗氧化能力,从而提高细胞对氧化损伤的抵抗并延缓细胞衰老。我们已经证明了这种遗传增强策略对中胚层细胞(如间充质干细胞和血管内皮细胞)是有效的。其他的细胞类型还未检测。我们认为这种策略不会对所有人类细胞类型都有增强效应。举个例子,有报道称神经干细胞的增殖是依赖于活性氧(ROS)的,因此NRF2的基因编辑可能不会在这种细胞类型中有效。因此,针对不同细胞类型的遗传增强,可能需要量体裁衣地制定“个性化”的基因编辑策略。

(6)GES细胞在治疗中的安全性如何?能解释一下吗?

杨济平:在此研究中,我们针对遗传增强策略的安全性进行了细致的评价。首先,尽管GES细胞具有更强的自我更新能力和体外传代寿命,但是在移植入免疫缺陷小鼠体内后并不会形成肿瘤。接下来,我们也考察了引入强致癌因子后GES细胞的成瘤能力,结果发现虽然野生型细胞可以被有效地转化成肿瘤,但GES细胞缺对癌基因诱导的“细胞癌变过程”保持着高度抵抗(包括保持着基因组的强稳定性),移植入免疫缺陷小鼠体内后不会形成肿瘤。这说明GES细胞的肿瘤易感性非但没有提高,反而非常抵抗恶性转化。另一方面,经过遗传增强的人类胚胎干细胞在免疫缺陷小鼠体内仅能产生比对照胚胎干细胞小得多的畸胎瘤。该结果提示了即便GES细胞移植物中混杂了少量未分化的多能干细胞,其在体内形成畸胎瘤的能力也会被大大削弱,这就进一步降低了利用遗传增强型多能干细胞进行细胞移植治疗的安全风险。

(7)该工作在认识细胞衰老和细胞致瘤性转化的分子机制方面有何意义?

杨济平:过去人们对NRF2的研究大多数是基于人类肿瘤细胞系,由此得出的实验结果多认为NRF2会促进肿瘤细胞的增殖和存活。而我们的工作是在正常非肿瘤细胞中通过基因敲入(增强内源NRF2功能)的研究证明了NRF2具有阻止正常细胞发生“癌变”的作用。这两者并不矛盾,因为已经癌变的细胞非常“聪明”,可能会利用NRF2的细胞保护机制实现自身的恶性;而我们证明的NRF2的抗癌防癌作用则表现为维持正常体细胞的基因组稳定,减少突变的发生,进而遏制细胞的恶性转化。我们基于基因编辑的研究为NRF2保护正常细胞的恶性转化提供了直接的证据。在此之前,人们并不明确内源性NRF2在非肿瘤的正常人类细胞中究竟发挥着抑癌或促癌的作用。另一方面,我们的研究也提供了NRF2激活抑制人类间充质干细胞衰老的直接证据。

(8)为何选择HDAdV基因编辑技术,而不是CRISPR/Cas9?

杨济平:我们最初起始该课题的研究时,CRISPR/Cas9技术才刚刚问世,尚没有得到在人类细胞中的应用。而同期我们课题组已经成功的利用HDAdV技术矫正或敲入了若干种人类致病基因突变。此外,由于HDAdV技术完全利用大片段DNA同源重组进行基因编辑,具有很低的安全隐患。并且我们在接下来的研究中也证明了HDAdV基因编辑技术的高度安全性(Cell Stem Cell 2014)。因此HDAdV技术是我们最好的选择。后来CRISPR/Cas9技术问世后,我们也尝试过利用该方法靶向编辑基因组。然而,由于我们需要改造NRF2基因上的单一核苷酸,因此在选择gRNA序列时希望尽可能的靠近该核苷酸。然而在此核苷酸附近可选择设计的gRNA序列有限,我们尝试了最靠近的3个gRNA序列,但是它们在人类胚胎干细胞中的基因组切割效率较低,不易实现同源重组。从技术层面上讲,并不是任何一个核苷酸的置换都可以用CRISPR/Cas9完成的。

(9)GES细胞在临床上可能具有哪些应用前景?

杨济平:从我们初步的动物体内移植实验结果看,NRF2编辑的间充质干细胞对血管系统的修复具有显著的作用。因此,我们认为基于NRF2基因编辑的GES细胞对与衰老相关的血管退行性病变可能具有较好的应用潜力。相关的疾病可能包括血管动脉粥样硬化、糖尿病足以及老年眼底血管病变等。具体的应用和效果需进行更多的临床前实验才能得出结论。

(10)GES细胞未来在技术和应用方面还可能进行哪些改进?

杨济平:我认为可能是遗传增强方案的个性化改进,针对不同的组织器官类型及疾病特性可以设计不同的遗传增强方案。包括对不同基因和不同信号通路的精细调控,对不同体细胞类型的定向改造等。我们也正在设计基于诱导多能干细胞ipsC)的遗传增强策略。此外,GES细胞配合特殊的生物材料载体也可能会产生更佳的治疗效果。

(11)是否已经考虑将这种技术推向临床?

杨济平:目前这项研究成果已经申请了国内和国际专利,我们已同国外和国内生物技术企业开展了合作,最终目标是将这项技术推向临床。


论文共同第一作者杨济平

 

论文共同第一作者李静宜

 

李静宜(左)和杨济平(右)

杨济平个人简历:

学习经历:

2008-2012 中国农业大学 本科

2012至今 中国科学院生物物理所 硕博研究生

发表论文:

1. Yang J*, Li J*, Suzuki K*, Liu X, Wu J, Zhang W, Ren R, Zhang W, Chan P, Belmonte JC, Qu J, Tang F, Liu GH. Genetic enhancement in cultured human adult stem cells conferred by a single nucleotide recording. Cell Research 2017.doi:10.1038/cr.2017 (*equal contribution)

2. Wang L, Yi F, Fu L, Yang J, Wang S, Wang Z, Suzuki K, Sun L, Xu X, Yu Y, Qiao J, Belmonte JC, Yang Z, Yuan Y, Qu J, Liu GH, CRISPR/Cas9-mediated targeted gene correction in amyotrophic lateral sclerosis patient ipsCs. Protein & cell 8, 365-378 (2017)

3. Pan H, Guan D, Liu X, Li J, Wang L, Wu J, Zhou J, Zhang W, Ren R, Zhang W, Li Y, Yang J, Hao Y, Yuan T, Yuan G, Wang H, Ju Z, Mao Z, Li J, Qu J, Tang F, Liu GH, SIRT6 safeguards human mesenchymal stem cells from oxidative stress by coactivating NRF2. Cell research 26, 190-205 (2016)

4. Kubben N, Zhang W, Wang L, Voss TC, Yang J, Qu J, Liu GH, Misteli T, Repression of the Antioxidant NRF2 Pathway in Premature Aging. Cell 165, 1361-1374 (2016)

5. Fu L, Xu X, Ren R, Wu J, Zhang W, Yang J, Ren X, Wang S, Zhao Y, Sun L, Yu Y, Wang Z, Yang Z, Yuan Y,  Qiao J, Belmonte JC, Qu J, Liu GH, Modeling xeroderma pigmentosum associated neurological pathologies with patients-derived ipsCs. Protein & cell 7, 210-221 (2016)

6. Duan S, Yuan G, Liu X, Ren R, Li J, Zhang W, Wu J, Xu X, Fu L, Li Y, Yang J, Zhang W, Bai R, Yi F, Suzuki K, Gao H, Esteban CR, Zhang C, Belmonte JC, Chen Z, Wang X, Jiang T, Qu J, Tang F, Liu GH, PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature communications 6, 10068 (2015)

7. Zhang W, Li J, Suzuki K, Qu J, Wang P, Zhou J, Liu X, Ren R, Xu X, Ocampo A, Yuan T, Yang J, Li Y, Shi L, Guan D, Pan H, Duan S, Ding Z, Li M, Yi F, Bai R, Wang Y, Chen C, Yang F, Li X, Wang Z, Aizawa E, Goebl A, Soligalla RD, Reddy P, Esteban CR, Tang F, Liu GH, Belmonte JC, Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science 348, 1160-1163 (2015)

8. Yang J*, Cai N*, Yi F*, Liu GH, Qu J, Belmonte JC, Gating pluripotency via nuclear pores. Trends in molecular medicine 20, 1-7 (2014) (*equal contribution)

9. Xu X, Yang JP, Fu LN, Ren RT, Yi F, Suzuki K, Liu K, Ding ZC, Qu J, Zhang WQ, Li Y, Yuan TT, Yuan GH, Sui LN, Guan D, Duan SL, Pan HZ, Wang P, Zhu XP, Montserrat N, Li M, Bai RJ, Liu L, Belmonte JC, Liu GH, Direct reprogramming of porcine fibroblasts to neural progenitor cells. Protein & cell 5, 4-7 (2014)

10. Gu Y, Liu GH, Plongthongkum N, Benner C, Yi F, Qu J, Suzuki K, Yang J, Zhang W, Li M, Montserrat N, Crespo I, Del Sol A, Esteban CR, Zhang K, Belmonte JC, Global DNA methylation and transcriptional analyses of human ESC-derived cardiomyocytes. Protein & cell 5, 59-68 (2014)

11. Wang P, Zhang W, Yang J, Qu J, Liu GH, Higher-order genomic organization in pluripotent stem cells. Protein & cell 3, 483-486 (2012)

杨济平博士生导师刘光慧简介:

刘光慧,研究员,中国科学院大学岗位教授。国家杰出青年科学基金获得者,干细胞国家重大科学研究计划(973)项目首席科学家。现任中国老年医学学会基础与转化医学分会副会长,中国老年医学研究机构联盟副主任委员,中国老年学和老年医学学会抗衰老分会副主任委员,中国细胞生物学学会干细胞生物学分会委员,中国生物物理学会理事,Protein &Cell杂志副主编。近年来在基因编辑、干细胞和衰老领域取得了系列原创性研究成果。回国后以通讯或共同通讯作者身份在Nature,Science,Cell,Cell Stem Cell, Cell Res和Nature Commun等杂志发表系列研究论文。授权或申请发明专利(第一发明人)14项。获首届老年医学杰出贡献奖。

文章链接:

http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201786a.html

(生物谷Bioon.com)

温馨提示:87%用户都在生物谷APP上阅读,扫描立刻下载! 天天精彩!


相关标签

最新会议 培训班 期刊库