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Cell:重大突破!首次从结构上揭示CRISPR-Cas3系统作用机制

来源:本站原创 2017-07-02 09:37


图片来自Cell,doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

2017年7月2日/生物谷BIOON/---在一项新的研究中,来自美国哈佛医学院和康奈尔大学的研究人员获得来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的I型CRISPR复合体的近原子分辨率的图片,揭示出它的作用机制的关键步骤。这些发现提供改善CRISPR在生物医学应用时的效率和准确性所需的结构数据。相关研究结果发表在2017年6月29日的Cell期刊上,论文标题为“Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System”。论文通信作者为哈佛医学院细胞生物徐助理教授Maofu Liao和康奈尔大学研究员Ailong Ke。

这些研究人员利用冷冻电子显微镜技术首次描述出当这种CRISPR复合体装载靶DNA并让它做好被Cas3酶切割的准备时准确发生的一系列事件。他们说,这些结构揭示出一种存在多层错误检测的过程,即存在阻止不想要的基因组损伤的分子冗余(molecular redundancy)。

CRISPR-Cas系统是一种广泛采用的用于生物医学研究的精准基因编辑工具。CRISPR-Cas3是CRISPR-Cas系统的一种亚型。然而,它的作用机制,特别是它如何寻找它的DNA靶标是不清楚的,而且对不想要的脱靶效应的担忧让人们猜测将CRISPR-Cas用于治疗人类疾病是否会存在安全性问题。

当利用这种CRISPR复合体进行基因编辑时,这些结构的高分辨率细节阐明了确保精确切割和避免脱靶效应的方法。

Liao说,“为了解决特异性问题,我们需要理解CRISPR复合体形成的每个步骤。我们的研究如今展示了入侵DNA如何被CRISPR捕获(从起初时的靶DNA识别到一种使得DNA发生构象变化而最终被Cas3切割的过程)的精确机制。”

CRISPR-Cas是一种被细菌用来抵抗病毒入侵的适应性防御机制。这一过程涉及细菌获得病毒DNA片段,并将这些片段整合到它的基因组中,并且产生短的被称作crRNA(CRISPR RNA)的 RNA序列。这些crRNA片段被用来观察“敌人”的存在。

为了更好地理解CRISPR-Cas如何发挥功能,Liao、Ke和他们的团队着重关注细菌中最常见的CRISPR亚型:1型CRISPR,即利用一种被称作CRISPR Cascade的核糖蛋白复合体(riboprotein complex)捕获DNA,并且利用酶Cas3切割外源DNA。

通过联合使用生化技术和冷冻电子显微镜技术,他们复原出在不同的功能状态下的稳定的Cascade,并且进一步获得Cascade在捕获和加工DNA时分辨率低至3.3埃(大约是一个碳原子直径的3倍)的图片。

在CRISPR-Cas3中,crRNA被装载到CRISPR Cascade上,随后寻找一段非常短的表明外源病毒DNA存在的DNA序列(被称作PAM)。

Liao、Ke和他们的同事们发现当Cascade检测PAM序列时,它让DNA呈锐角弯曲,迫使一小段DNA解链。这允许crRNA的一个长11nt的片段结合到靶DNA链上,形成一种“种泡(seed bubble)”。

这种种泡发挥一种自动防故障装置的作用,检查靶DNA是否匹配crRNA。如果它们正确地匹配,那么这种种泡就会扩大,crRNA的剩余部分就与它对应的靶DNA结合,形成一种“R环(R-loop)”结构。

一旦这种R环完全形成,这种CRISPR Cascade复合体经历一种构象变化,从而将靶DNA锁定。它也让DNA的第二条非靶标链产生一个凸起,这个凸起被移交到这种CRISPR Cascade复合体的一个不同位置上供Cas3酶切割。

仅当一种完整的R环形成时,Cas3酶才结合和切割在这条非靶标DNA链上产生的这个凸起上的DNA。

这些发现揭示出一种精心设计的分子冗余确保精准切割和避免错误地切割细菌自己的DNA。

Ke说,“为了将CRISPR用于人类医学中,我们必须确保CRISPR系统是准确的,它不会靶向错误的基因。我们的观点是CRISPR-Cas3亚型已进化为一种精准的系统,有潜力成为一种更加精准的用于基因编辑的系统。即便存在错误靶向,我们也知道如何操纵这个系统,这是因为我们知道哪些步骤参与其中,以及我们可能在何处进行干预。”(生物谷 Bioon.com)

参考资料:

1.Yibei Xiao, Min Luo, Robert P. Hayes et al. Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System. Cell, 29 June 2017, 170(1):48–60, doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

2.New study reveals key steps in CRISPR-Cas3 function at near-atomic resolution

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