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国内长非编码RNA又一篇cell!9张图带你看完sno-lncRNA的研究历程

来源:Anna H/生物谷 2017-05-08 17:25

5月4日,上海生化所的陈玲玲研究员在cell上发表题为《SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription》的文章,该研究揭示了长非编码RNA SLERT通过松弛DDX21的环形结构,从而促进Pol I转录 rRNA的重要作用。

值得注意的是,SLERT是一个sno-lncRNA。Sno-lncRNA是一类新型的长非编码RNA,它们的序列中包含完整的snoRNA序列,并且该序列对sno-lncRNA的稳定性和亚细胞定位至关重要。sno-lncRNA在2012年由陈玲玲课题组率先鉴定出来,至今,已有3篇有关sno-lncRNA功能的文章在顶级期刊上发表,均出自该课题组。

随着二代测序技术和生物信息学的发展,RNA测序的门槛渐低,越来越多的实验室可以独立开展RNA测序的分析和研究,那么,是什么原因使得陈玲玲研究员课题组脱颖而出,发现了这样一类特殊的长非编码RNA呢?下面,小编将用9幅图带大家回顾sno-lncRNA的发现和研究历程。

2011年,陈玲玲研究员在Genome Biology上发表题为《Genomewide characterization of non-polyadenylated RNAs》的文章,该文虽未提及sno-lncRNA,但却是这类全新的长非编码RNA研究的开端。我们知道,mRNA的3’poly(A)对其稳定性非常重要,大部分长非编码RNA也有3’poly(A),但细胞中存在一类没有ploy(A)的RNA,为了研究这类RNA如何维持自身的稳定性,他们首先对此类RNA进行了系统的鉴定。

图1.1,是RNA-seq的建库方法,通过3次oligo(dT)的洗脱,剩下的RNA经2次去rRNA处理,最终得到的RNA被认为是non-poly(A) RNA(也称为poly(A)-RNA)。将poly(A)-RNA和poly(A)+RNA进行测序分析,研究人员首次得到了最全的poly(A)-RNA和poly(A)+RNA测序数据。并对含有不同长度的poly(A)的RNA的比例及poly(A)-RNA的来源做了分析(图1.2和图1.3)。



2012年,陈玲玲组通过分析poly(A)-RNA的数据在Molecular Cell发表首篇有关sno-lncRNA 的文章《Long Noncoding RNAs wuth snoRNA Ends》。该研究首次鉴定了5个sno-lncRNA,分别命名为sno-lncRNA1, sno-lncRNA2, sno-lncRNA3, sno-lncRNA4和sno-lncRNA5,他们均是包含2个snoRNA,并且位于3’和5’端(图2.1)。通过进一步的研究,发现两端的snoRNA对sno-lncRNA的稳定性至关重要(图2.2),并且5个sno-lncRNA均定位在细胞核,与产生它们的母基因完美重合(图2.3)。



这里需要补充的是,产生sno-lncRNA的基因位点与普瑞德威利氏症候群紧密相关。该疾病由产生sno-lncRNA的基因位点(该基因位点包括SNORD116及IPW等基因)的缺失引发,导致患者肥胖及智力低下。sno-lncRNA在患者的基因组中的缺失,是否是疾病发生的原因呢?为了探究sno-lncRNA的功能,研究者使用RNAi的技术敲低了这5个sno-lncRNA,发现与神经发育等相关的基因发生了可变剪切(图3.1)。通过分析CLIP-seq数据,发现5个sno-lncRNA均与剪切因子FOX2结合,并影响FOX2的功能(图3.2)。最后提出sno-lncRNA通过与FOX2作用,保证发育正常进行的假说(图3.2)。



2014年,陈玲玲课题组在BMC Genomics发表题为《Species-specific alternative splicing leads to unique expression of sno-lncRNAs》的文章,系统鉴定了不同物种间的sno-lncRNA,并发现sno-lncRNA具有很强的物种特异性(图4)。



2016年,陈玲玲组在Molecular Cell上发表文章《Unusual Processing Generates SPA LncRNAs that Sequester Multiple RNA Binding Proteins》。有趣的是,这篇文章的主角——SPA,是一个5’端由snoRNA构成,3’端却有poly(A)的sno-lncRNA(图5.1),而之前鉴定的sno-lncRNA都是两端都由snoRNA构成。这样特别的sno-lncRNA是如何产生的呢?通过一系列实验,研究人员认为SPA的产生需要snoRNA,弱poly(A)信号以及快速的RNA聚合酶II(图5.2)。



那么,SPA又有什么样的功能呢?我们注意到,在2012年的那篇文章中,缺少敲低sno-lncRNA后的细胞表型实验的结果,而SPA的产生位点与sno-lncRNA1-5相近,SPA的缺失与普瑞德威利氏症候群有关吗?研究者利用CRISPR技术,对SPA进行了基因位点的敲除,但是并没有观察到该基因的缺失对细胞的增殖和凋亡有影响。对此,研究者给出的解释是由于普瑞德威利氏症候群并不是致死的疾病,所以SPA的敲除应该与发育相关,而不是细胞的增殖。但由于正如小编之前提到的,sno-lncRNA在物种间并不保守,小鼠中没有相应的SPA,所以也很难从动物模型的角度证明SPA的功能。

关于SPA在细胞中扮演的角色,研究者通过SIM和RNA pulldown技术发现,SPA可与TD43,RBFOX2及hnRNP结合(图6.1)影响基因的可变剪接(图6.2)。至此,本研究鉴定了新的lncRNA,即5’是snoRNA,3’是poly(A)的SPA。并形成了该类lncRNA的产生需要快速转录的RNA聚合酶II,上游弱poly(A)信号以及snoRNAd 保护及通过结合RNA结合蛋白影响RNA可变剪接发挥作用的假说(图6.3)。



时间回到现在,又回到了我们在文章开篇提到的文章《SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription》。与前两篇文章鉴定sno-lncRNA不同,SLERT的基因位置并不是15号染色体上缺失会导致普瑞德威利氏症候群的区域。SLERT来自7号染色体,母基因为TBRG4(图7.1),由TBRG4 mRNA的可变剪接形成。与sno-lncRNA1-5类似,SLERT的两端由snoRNA构成,并负责维持其稳定性(图7.2)。巧合的是,SLERT也在细胞核中,精确定位在核仁中,snoRNA序列对其亚细胞定位有决定性作用(图7.3)。



由于核仁与rRNA的合成息息相关,而rRNA的异常表达与疾病紧密相连,所以研究者们很快将研究重点放到了SLERT是否影响rRNA合成及如何影响。利用CRISP技术敲除SLERT后,非常幸运,研究者发现rRNA发生了变化(图9.1)。通过RNA pull down技术找到与SLERT结合的DDX21蛋白。DDX21可以形成环状结构,并将Pol l包裹其中,阻碍Pol l对rRNA基因的转录。利用SIM技术,研究人员拍了一张非常惊艳的图。从图8.3,我们可以清楚的看到SLERT与DDX21及RPA194形成复合体。那么SLERT与DDX21的结合是如何影响Pol l的转录的呢?研究人员通过细致的研究,发现SLERT可以改变DDX21的构象——环的大小,从而影响DDX21对Pol l的抑制作用(图8.4)。



文章到此,已经清楚的证明SLERT如何影响rRNA的合成,那么接下来的问题是,SLERT在细胞中,特别是肿瘤细胞中扮演了什么样的角色。(想起之前的sno-lncRNA均没有表型图,那么SLERT是否让人眼前一亮呢?)研究人员检测了敲除SLERT后细胞的表型,发现细胞增殖明显降低,小鼠成瘤实验也证实了这一点(图9)。至此,陈玲玲老师给我们展现了SLERT的一个非常完整的研究。

图9.假说及表型


9幅图讲完了,相信大家对sno-lncRNA的研究也有了认识,细胞中其他的sno-lncRNA又扮演了怎样的角色,又将向我们讲述怎样的故事呢?期待更多的研究!
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