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2017年4月CRISPR/Cas亮点盘点

来源:生物谷 2017-04-30 15:11

2017年4月30日/生物谷BIOON/---基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

即将过去的4月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。

1.Nat Biotechnol:利用CRISPR表观基因组编辑鉴定人基因组中的功能性调节元件
doi:10.1038/nbt.3853
图片来自Bryan Satalino。

大多数DNA并不编码蛋白。了解这种基因组“暗物质”如何和何时在基因调节的何处发挥作用是一个巨大的任务。如今,科学家们开发出的一种工具可能提供帮助。在一篇于2017年4月3日在线发表在Nature Biotechnology期刊上的论文中,来自美国杜克大学的研究人员描述了一种高通量筛选技术:利用CRISPR-Cas9表观基因组编辑鉴定人细胞基因组中的调节元件。这篇论文的标题为“CRISPR–Cas9 epigenome editing enables high-throughput screening for functional regulatory elements in the human genome”。论文通信作者为来自杜克大学的Gregory E Crawford、Timothy E Reddy和Charles A Gersbach。

研究结果证实导致更常见的复杂疾病(如心血管疾病、糖尿病和神经系统疾病)的大多数基因变异实际上发生于基因之间的调节区域。令人兴奋的事情是有方法对非编码基因组的功能进行标注。

Gersbach和同事们构建出靶向两个感兴趣的基因位点β-globin和HER2周围的几百万个碱基中的潜在调节元件的向导RNA(gRNA)文库。他们随后产生整合着荧光蛋白的细胞系,其中这种荧光蛋白指示靶基因激活。

这些研究人员将核酸酶活性已被灭活的两种Cas9蛋白版本(被称作dCas9)--- dCas9抑制版本(dCas9KRAB)和dCas9激活版本(dCas9p300)---中的一种导入到他们产生的细胞系中。dCas9KRAB招募让组蛋白H3K9发生甲基化的蛋白,从而导致异染色质形成和靶序列上的基因抑制。dCas9p300结合到靶DNA增强子或启动子上,促进组蛋白H3K27发生乙酰化,从而导致基因激活。

接下来,这些研究人员将较低水平的gRNA文库导入到他们产生的细胞系中以便确保单个gRNA存在于每个细胞中。他们随后基于荧光分选这些细胞,并且对存在于发生特别高水平和低水平靶基因表达的细胞中的gRNA进行测序。

序列鉴定印证了已知的调节元件,并且揭示出其他的DNA序列的新作用。很多这些序列(尽管不是所有序列)出现在dCas9KRAB筛选和dCas9p300筛选中。一些序列似乎对一种细胞类型中的基因发挥着调节作用,但是对另一种细胞类型中的相同基因并不会起着调节作用。尽管这些观察到的基因表达变化是微妙的,但是这些研究人员证实了单个DNA序列的调节作用。

2.Nature:“武林高手”细菌CRISPR系统VS病毒,以快为尊
doi:10.1038/nature21719

CRISPR是一种细菌免疫系统。它也是一种强大的基因组编辑工具。在与病毒的斗争当中,打响的第一枪通常是注射。想要感染细菌的病毒刺入细菌细胞的保护性细胞壁,注入它自己的遗传密码。如今,来自美国洛克菲勒大学的一项新的研究揭示出细菌如何利用CRISPR快速地抵抗这种到来的威胁。这一发现解答了一个由来已久的CRISPR如何发挥作用的难题。相关研究结果于2017年3月29日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“CRISPR–Cas systems exploit viral DNA injection to establish and maintain adaptive immunity”。

科学家们已经了解的基础事实是:当细菌细胞被病毒DNA入侵时,它的CRISPR系统捕获病毒的DNA片段(即间隔序列),并对这些DNA片段进行登记。一旦相同的病毒再次入侵,这种CRISPR系统就快速地识别它。

论文通信作者、洛克菲勒大学细菌学实验室主任Luciano A. Marraffini说,“大约10年来,我们已知道CRISPR系统通过获取病毒DNA片段发挥作用,但是在CRISPR免疫系统中这种关键的步骤在感染期间何时发生仍然是个谜。”他研究当地细菌中的CRISPR系统。

为了阐明这种时间安排,Marraffini和他的团队设计实验:在不同的时间点上阻止病毒生命周期。博士后研究员Joshua W. Modell和研究生Wenyan Jiang随后研究了CRISPR系统以便观察它何时和如何获得来自病毒的间隔序列(spacer)。

并不是任何病毒DNA都对CRISPR有用。之前的研究已证实,它偏好来自DNA松散末端的间隔序列。这种偏好缩小了它的选择,这是因为病毒DNA仅在感染的某些时间点采取线性形式,而在它的感染的剩余时间,它的DNA两个末端连接在一起,形成一种环形结构。

Marraffini团队在三个时间点上阻止这种病毒感染。但是不论他们在何时阻断这种感染,CRISPR持续地获得间隔序列,这表明它从一开始,也就是在病毒注射它的基因组到细菌细胞中的时候,就获得它们。

这种时间安排比较重要。通过从病毒首先注入细菌细胞中的DNA末端获得间隔序列,CRISPR确保一旦这种感染下次再次出现,它就攻击这种病毒。当Marraffini团队改变CRISPR系统使得它含有与病毒最后注入细菌细胞中的DNA末端相匹配的间隔序列时,病毒仍然能够增殖。

3.Cell:重磅!揭示抗CRISPR蛋白阻断CRISPR系统机制
doi:10.1016/j.cell.2017.03.012
想象一下细菌和病毒一直处于军备竞赛之中。对很多细菌而言,一种抵抗病毒感染的防御线是一种复杂的RNA引导的“免疫系统”,即CRISPR-Cas。这个免疫系统的核心是一种识别病毒DNA和触发它破坏的监视复合物。然而,病毒能够反击,利用抗CRISPR蛋白让这种监视复合物不能够发挥功能。但是,在此之前,没有人准确地知道这些抗CRISPR蛋白如何发挥作用。

如今,来自美国国家过敏症与传染病研究所、斯克里普斯研究所、蒙大拿州立大学、加州大学旧金山分校和加拿大多伦多大学的研究人员首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附着到一种细菌CRISPR监视复合物上时的结构。他们发现抗CRISPR蛋白的作用机制是封锁CRISPR识别和攻击病毒基因组的能力。一种抗CRISPR蛋白甚至“模拟”DNA,让这种crRNA(CRISPR经转录产生的RNA)引导的检测机器脱轨。相关研究结果发表在2017年3月23日的Cell期刊上,论文标题为“Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex”。论文通信作者为来自斯克里普斯研究所的Gabriel C. Lander和来自蒙大拿州立大学的Blake Wiedenheft。

利用一种被称作冷冻电镜的高分辨率成像技术,这些研究人员发现了CRISPR系统和抗CRISPR蛋白的三个重要的方面。

首先,他们准确地观察这种CRISPR监视复合物如何识别病毒遗传物质以便发现它应当在何处发起攻击。这种监视复合物中的蛋白像握手那样缠绕在细菌crRNA的周围,让这种crRNA的特定片段暴露出来。这种特定片段扫描病毒DNA,寻找它们能够识别的基因序列。再者,这些研究人员分析了病毒抗CRISPR蛋白如何瘫痪这种监视复合物。他们发现一种抗CRISPR蛋白覆盖住crRNA的这个暴露片段,从而阻止这种CRISPR系统扫描病毒DNA。

另一种抗CRISPR蛋白采用一种不同的策略。基于这种抗CRISPR蛋白的结合位置和负电荷,这些研究人员认为它起着模拟DNA的作用,诱导CRISPR结合这种抗CRISPR蛋白,而不是入侵的病毒DNA。

这些研究人员认为这种对抗CRISPR蛋白的新认识可能最终导致人们开发出更加复杂的和更加高效的基因编辑工具。抗CRISPR蛋白可能能够被用于CRISPR系统之中来迅速阻断基因编辑,或者科学家们可能能够降解抗CRISPR蛋白来触发基因编辑。

4.Nat Commun:利用CRISPR/Cas9发现新的衣原体药物靶标
doi:10.1038/ncomms15013

在一项新的研究中,来自英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格研究所和加拿大英属哥伦比亚大学的研究人员开出一种创新性的技术来研究衣原体如何与人免疫系统相互作用。这些研究人员组合使用基因编辑技术和干细胞技术来构建这种研究模型。他们鉴定出我们的免疫系统中的两个基因IRF5和IL-10RA在抵抗衣原体感染中发挥着关键性的作用。这些结果为治疗由衣原体导致的这种性传播疾病鉴定出新的药物靶标。相关研究结果于2017年4月25日在线发表在Nature Communications期刊上,论文标题为“Exploiting induced pluripotent stem cell-derived macrophages to unravel host factors influencing Chlamydia trachomatis pathogenesis”。

在这项研究中,这些研究人员利用人诱导性多能干细胞(iPS细胞)制造出被称作巨噬细胞的白细胞来研究衣原体感染。巨噬细胞在杀死衣原体限制它的感染中发挥着至关重要的作用。利用人iPS细胞产生的巨噬细胞以类似于从人血液之中获得的巨噬细胞的方式对这种感染作出反应,这意味着它们比根据之前的方法产生的那些细胞更加类似于人体内的巨噬细胞。这种新的模型将能够让科学家们研究衣原体如何与人免疫系统相互作用从而避免抗生素耐药性产生和疾病扩散。

这些研究人员利用CRISPR/Cas9对人iPS细胞进行基因编辑,然后观察这种基因操纵对它们产生的巨噬细胞抵抗衣原体感染能力的影响。他们特别地发现了两个巨噬细胞基因IRF5和IL-10RA在限制衣原体感染中发挥着关键作用。当这两个基因被关闭时,这些巨噬细胞更容易遭受衣原体感染。这些结果提示着这两个基因可能成为抵抗衣原体感染的新的药物靶标。

5.Cell Res:利用CRISPR技术能够恢复视力

doi:10.1038/cr.2017.57
图片来自National Center for Microscopy and Imaging Research, UC San Diego。

利用基因标记技术"CRISPR/CAS9",来自加州圣地亚哥分校的研究者与来自中国的研究者们能够将突变的杆状光学受体修复,使其功能恢复正常,这一技术成功地使两种不同类型的患有视网膜退行性疾病的小鼠的视力恢复了正常。相关结果发表在最近的《Cell Research》杂志上。

视网膜退行性疾病(Retinitis pigmentosa:RP)是一类遗传性的视觉损伤疾病,其中存在60多个基因的突变。这些突变基因影响了眼睛光受体(即眼睛中一类感受光线,并将其转换为电信号传送到大脑中的特殊细胞类型)。目前存在两种光受体细胞,杆状细胞主要负责夜间的光信号以及余光信号,锥细胞负责中心的视觉信号以及颜色的分辨。人们的视网膜中含有1.2亿的杆细胞以及6百万的锥细胞。

在这项研究中,作者们利用CRISPR/CAS9系统抑制了一类关键基因Nrl以及下游的转录因子Nr2e3的活性。这种方法能够将杆状细胞分化形成锥状细胞。"锥状细胞的遗传突变引发RP的风险相对较低一些,我们的方案因此能够降低RP的症状的发生几率"。他们在两种不同的小鼠模型中试验了上述方法。结果表明,这一方法能够有效地将杆状细胞转变为锥状细胞,而且小鼠的视力了得到了明显的改善。

6.CRISPR“挑战”抗生素!或解决全球耐药问题!

近几年来,抗生素滥用导致的全球健康问题日益凸显,越来越多的科学家开始寻找新的方法以对付诸如艰难梭菌(Clostridium difficile)等致命细菌带来的感染问题。在这其中最为引人注目的,可以说是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的“有害菌自毁CRISPR药丸”。

美国威斯康星大学麦迪逊分校食品科学家Jan-Peter Van Pijkeren表示,科学家们希望将CRISPR/Cas9系统转变超为一种精细微生物治疗体系,以精确杀死那些潜在的致命细菌。Van Pijkeren等人希望能够使用噬菌体向艰难梭菌发送一个错误信息,使细菌对自己的DNA进行致死切割。

为了做到这一点,Van Pijkeren实验室正在开发能够携带特定CRISPR信息的噬菌体。为了让病毒进入病人体内,Pijkeren团队计划将其感染至无毒细菌或益生菌混合物中,以药丸或液体的形式为病人所直接摄入。当益生菌通过人体肠道被胃酸分解时,噬菌体就能够爆发并感染任何附近的艰难梭菌,注入特定的CRISPR序列促进艰难梭菌自毁。

在Van Pijkeren的研究之前,使用噬菌体触发CRISPR有效杀死皮肤细菌,帮助打击发展中国家常见的腹泻与感染志贺氏菌疾病已经被学术界所证实。

目前,包括法国Eligo Bioscience和美国Locus Biosciences等公司都开始在商业上推行基于CRISPR/Cas9的抗菌药物。

7.Nat Commun:科学家成功利用CRISPR-Cas9技术追踪活细胞内基因的表达
doi:10.1038/ncomms14725
近日,刊登在国际杂志Nature Communications上的一篇研究报告中,来自弗吉尼亚大学医学院的研究人员通过研究开发出了一种能够追踪活细胞中基因表达的新方法,研究者表示,他们能够让这些基因变红,并且观察其在三维空间中的运动方式,这样就能够像天空的星空图一样记录基因的位置;类似于月亮会影响潮汐一样,基因的位置也会影响其所带来的效应,基因位置的3D图谱或许就能够帮助科学家们深入理解基因的作用机理及其影响人类健康的分子机制。

研究者Mazhar Adli表示,一直以来我都有一个梦想,就是实时对活细胞中任何基因组区域进行成像,利用金标准式的传统方法研究者或许永远无法获取到相关数据,因为我们不得不杀灭所要成像的细胞;然而本文中研究者所开发的方法就可以对活细胞进行实时观测。一般情况下DNA会聚集到细胞核中,我们都知道DNA并不是线性的,其会形成一些环状结构(大型的三维环状结构),研究者想从根本上对这些DNA的相互作用进行成像,并且阐明基因组是如何被组装形成三维结构的。

这项研究中,研究者利用CRISPR基因编辑系统进行研究,首先他们利用荧光蛋白对特殊的基因组区域进行了标记,随后利用CRISPR对染色体进行成像,随后研究者就能够根据自己的意愿来开启或关闭基因的表达,同时还能够利用成像工具来观察所染色体中基因所发生的变化。

这种新方法克服了长期以来基因成像技术的限制,研究者Adli说道,我们被告知永远无法进行这种操作,目前有一些方法能够让我们在三维空间中对染色体进行研究,但如果要对成百上千万个细胞进行研究的话就必须杀死这些细胞;而本文研究中我们在单一细胞水平下进行了相关研究,同时细胞仍然能够保持活性,这样我们就能够以看电影的形式来观看细胞中所发生的的变化。

8.Science:基于CRISPR/Cas13a的诊断平台可检测任何RNA分子,灵敏度增加一百万倍
doi:10.1126/science.aam9321
图片来自Susanna M. Hamilton/Broad Communications。

在一项新的研究中,来自美国哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所(以下简称布罗德研究所)、麻省理工学院麦戈文脑研究所、麻省理工学院医学工程与科学研究所、哈佛大学怀斯生物启发工程研究所(Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering)的研究人员将一种靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相关酶(即Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具,从而有潜力引发研究和全球公共卫生变革。相关研究结果于2017年4月13日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在这项研究中,布罗德研究所成员Feng Zhang、Jim Collins、Deb Hung、Aviv Regev和Pardis Sabeti描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶如何被用作一种高度灵敏的检测器---能够指示最少至一个靶RNA或DNA分子的存在。论文第一作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg将这种新的工具称为“SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)”;这种技术可能有朝一日被用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症。

在2016年6月,Zhang和他的同事们首次描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶(之前被称作C2c2,如今被称作Cas13a),而且能够经编程后切割细菌细胞中的特定RNA序列(Science, Published online:02 Jun 2016, doi:10.1126/science.aaf5573)。不同于靶向DNA的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a能够在切割它的靶RNA之后保持活性,而且可能表现出不加区别的切割活性,而且在一系列被称作“附带切割(collateral cleavage)”的作用当中,继续切割其他的非靶RNA。在其发表的论文和申请的专利中,该团队描述了这个CRISPR系统的广泛生物技术应用,包括将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

在这项新的研究中,这种SHERLOCK方法的灵敏度增加了一百万倍。这种增加是由于Zhang团队和布罗德研究所成员Jim Collins合作开展研究取得的结果。Collins之前一直在研究寨卡病毒的诊断方法(Cell, 19 May 2016, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059)。在2014年,Collins和他在怀斯生物启发工程研究所的团队开发出一种快速的基于合成纸的埃博拉病毒测试方法,该方法所使用的试剂能够在室温下运输和储存。他们随后对这种测试系统进行修改来检测寨卡病毒,并且证实他们能够通过加入低水平热量来提高RNA在样品中的浓度来提高这种系统的检测灵敏度。 通过一起合作,Zhang团队和Collins团队能够采用一种不同的依赖体温的扩增过程来提高他们的测试样品中的DNA或RNA水平。一旦这种水平增加,他们利用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA,从而使得他们将这种靶向RNA 的CRISPR工具的灵敏度增加了一百万倍,而且这种工具能够在几乎任何环境下使用。

另外,这种CRISPR工具还包括一种RNA报告分子。当该报告分子被切割时,它会发出荧光。当Cas13a检测到靶RNA序列时,它的无区分的RNA酶活性(即附带切割活性)也会切割这种RNA报告分子,从而释放可检测到的荧光信号。

9.俄美科学家发现新型 CRISPR-Cas 系统

来自俄罗斯斯科尔科沃科技学院和美国国立卫生研究所及麻省理工学院的联合科研团队发现了具有适应性细菌防御功能的新型 CRISPR-Cas 系统,此类系统可用于研发基因编辑及基因组检测新方法。该成果刊登在《Nature Reviews Microbiology》科学期刊上。

斯科尔科沃科技学院课题组进行了基因组数据库中 CRISPR-Cas 系统特殊成分大规模筛查工作,由此发现了此类新型系统,课题组所发现的系统非同一般,与此前的研究相比类型完全不同。由于筛查了几乎所有的原核生物基因组数据,可以认为,原核生物 CRISPR-Cas 系统的主要类型都已经被发现。

科研团队进行了大量的生物信息分析工作,识别出之前未知的新型 CRISPR-Cas 系统,并进行了深入的理论和试验定性研究。研究确定,VI- B 型系统中的补充蛋白具有系统运行调节作用;而 V - U 型系统则采用更小分子量的蛋白进行免疫防御,该特点使其在基因工程领域具有广泛的应用前景,因为小分子蛋白更易于操作。目前俄美联合课题组正详细研究该系统类型的特点,探索研发新型抗生素。

10.Sci Adv:重磅!研究人员使用CRISPR-Cpf1治疗杜氏肌营养不良
doi:10.1126/sciadv.1602814

德州大学西南医学研究中心研究员利用新的基因编辑酶CRISPR-Cpf1在实验室了人类细胞和老鼠体内的杜氏肌营养不良。该研究组过去使用原有的基因编辑系统CRISPR-Cas9纠正患有此病的老鼠模型和人类细胞内的杜氏肌缺陷。在目前的研究中,他们使用一种新的基因编辑系统,用于修复老鼠模型和人类细胞中的缺陷。

“我们研究了最常见的导致杜氏肌营养不良的患者细胞。我们在体外对它们进行纠正,以恢复细胞内缺失的抗肌营养不良蛋白。这项研究提供给了我们CRISPR工具箱中一个很有潜力的工具,” Wellstone肌肉萎缩联合研究中心、Hamon再生科学和医学中心主任、分子生物学主席Eric Olson博士说。该研究发表于Science Advances杂志。

CRISPR-Cpf1在很多关键方面不同于CRISPR-Cas9。Cpf1比Cas9酶小很多,这就使之更容易包装到病毒内,因此也更加容易进入肌细胞。与Cas9 相比,它也能识别不同的DNA序列。就其实用性而言,它提供了更大的灵活性。“有一些基因很难用Cas9编辑,但是更容易用Cpf1修饰。因为这两种蛋白质有不同的生化性质,能识别不同的DNA序列,所以这些特性能为基因编辑创造更多的选择,”先天性心脏缺陷研究杰出教授Olson博士说。

“通过敲除突变区域或精确修复突变基因,CRISPR-Cpf1介导的基因编辑不仅纠正了杜氏肌萎缩症突变,而且还改善了肌肉收缩能力和强度,”分子生物学教授、Hamon再生科学和医学研究中心副主任、Rhonda Bassel的合著者Duby博士说。

11.Nat Biotechnol:首次在人全基因组水平上证实基于CRISPR的单碱基校正是准确的
doi:10.1038/nbt.3852
图片来自Institute for Basic Science。

在一项新的研究中,来自韩国基础科学研究所(Institute for Basic Science, IBS)基因组工程中心的研究人员证实了一种近期开发的基因编辑方法的准确性。这种基因编辑工具起着“DNA剪刀”的作用,旨在鉴定和替换人基因组(大小为30亿个碱基对)中的仅一个核苷酸(或者说碱基)。这是首次在全基因组水平上验证了这种“碱基编辑器(base editor)”的准确性。这种验证将有助扩大这种方法在农业、牲畜和基因疗法中的应用。相关研究结果于2017年4月10日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases”。论文通信作者为来自IBS基因组工程中心的Seuk-Min Ryu和Jin-Soo Kim。

基因编辑工具取得的快速进展已在生物界引起了很大轰动。一种主要的第三代DNA编辑技术是CRISPR。通过切除一小段DNA序列,CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1被用来沉默或降低有缺陷的基因的表达。然而,去年,生物学家们已发现一种新的碱基编辑器并不导致随机的DNA删除和插入,而是仅替换一个DNA碱基。不同于现存技术的是,在这种碱基编辑器中,CRISPR-Cas9的一种变体(nCas9, 切口酶)与胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)APOBEC1融合在一起。APOBEC1将DNA中的碱基C替换为碱基T。这种DNA剪刀被向导RNA(gRNA)引导到DNA的正确位点上。然而,在此之前,人们并不知道这种碱基编辑器是否仅在有缺陷的基因区域上发挥作用,或者它是否在脱靶位点上不必要地将碱基C替换为碱基T。

仅一个月之前,Kim团队就在Nature Biotechnology期刊上报道首次成功地在小鼠体内进行单碱基编辑(Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.3816,相关新闻参见“Nat Biotechnol:首次利用CRISPR培育出单核苷酸编辑转基因小鼠”)。如今,该团队在全基因组水平上证实了这种方法的准确性。

为了鉴定这种方法的可靠性,Kim团队对一种被称作Digenome-seq的错误校验技术进行改进,以便让它适用于这种碱基编辑器方法。去年,当该团队分析了CRISPR-Cpf1和CRISPR-Cas9的准确性时,他们就使用和验证了Digenome-seq。他们也改进了计算机程序Digenome 2.0以便更加全面地鉴定脱靶位点,并且通过比较不同的gRNA发现降低脱靶编辑和增加特异性的gRNA。

12.Nat Chem Biol:利用CRISPR-Cas9激活细菌中沉默的基因簇,有望发现新的药物
doi:10.1038/nchembio.2341

为了抵抗疾病,很多医药库中的武器是从细菌当中获得的。如今,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,研究人员揭示出沉默基因中隐藏着的更多潜在的宝藏。

作为一类常见的细菌,链霉菌被用来产生很多作为抗生素、抗癌试剂和其他药物的化合物。在一项新的研究中,来自美国伊利诺伊大学和新加坡科技研究局的研究人员利用CRISPR-Cas9技术激活链霉菌中不表达的或者说沉默的基因簇。相关研究结果于2017年4月10日在线发表在Nature Chemical Biology期刊上,论文标题为“CRISPR–Cas9 strategy for activation of silent Streptomyces biosynthetic gene clusters”。论文通信作者为伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学与与生化分子工程系教授Huimin Zhao。

为了挖掘未发现的基因组宝藏,这些研究人员首先利用计算工具鉴定出沉默的生物合成基因簇,即一小群参与制造化学产物的基因。他们随后利用CRISPR/Cas9技术将一种强启动子序列插入到他们想要激活的基因前面,促使细菌细胞制造这些基因簇编码的天然产物。

这些研究人员成功地激活了一些沉默的生物合成基因簇。为了寻找候选药物,每个天然产物需要加以分离和研究以便确定它发挥什么功能。为此,从一种沉默的生物合成基因簇经激活产生的新的化合物当中,他们分离出一种化合物并且确定了它的结构。他们发现它具有与源自链霉菌的其他药物完全不同的结构。

13.科学家利用基因编辑技术剔除小鼠艾滋病病毒
doi:10.1016/j.ymthe.2017.03.012
美国天普大学华人科学家胡文辉等人近日报告说,他们利用基因编辑技术,有效剔除了一种人源化小鼠多个器官组织中的人类艾滋病病毒,朝着开展人类临床试验的方向迈出一大步。

在发表于美国《分子治疗》杂志的最新研究中,胡文辉和同校同事卡迈勒·哈利利以及匹兹堡大学杨文彬等人首先利用艾滋病病毒感染人源化BLT小鼠,然后借助腺相关病毒(AAV)作为载体,把有“基因剪刀”之称的CRISPR/Cas9基因编辑工具运送到潜伏感染小鼠体内。2到4周后,他们在多个小鼠器官组织中检测到艾滋病病毒基因组被切除。

胡文辉副教授告诉新华社记者,艾滋病病毒基因易于突变,应用单靶点基因编辑有可能会出现病毒逃逸现象。为此,他们提出了多靶点基因编辑的新思路,针对艾滋病病毒转录区和结构区设计了4个向导RNA(核糖核酸),可引导Cas9酶到预定位置实现多靶点切除,显着增加了艾滋病病毒的剔除效率。此外,这种病毒剔除方法不影响靶细胞的存活和功能,即“只杀病毒不杀细胞”。

胡文辉指出,目前,基因编辑疗法尚不能100%清除动物体内的艾滋病病毒,但能够显着降低潜伏病毒量,因此与抗逆转录病毒药物组合使用不失为一种有希望的艾滋病治疗策略。

14.哈工大黄志伟课题组最新Nature!揭示魔剪CRISPR“抑制开关”分子机制
doi:10.1038/nature22377

4 月 28 日,哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组在《自然》(《Nature》)在线发表了题目为《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子机制》(Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein)的研究论文。

早先的研究发现一类来自于 Listeria monocytogenes 前噬菌体的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在细胞内能够抑制 SpyCas9 的基因编辑活性,然而这些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子机制并不清楚。

为了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能够直接结合 SpyCas9,课题组首先建立体外生物化学研究系统,研究发现 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和结合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用,而和单独 SpyCas9 并没有相互作用;进一步实验发现 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能够直接抑制 SpyCas9 介导的目的 DNA 的剪切。

为了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子机制,课题组纯化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物,并通过结构生物学研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构,该复合物结构揭示 AcrIIA4 蛋白构象是一个新的折叠,它结合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三个结构域形成的凹槽区域。该凹槽区域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的结合位点;另外来自 AcrIIA4 的β1 折叠片前的 Loop 与 RuvC 活性位点接触也加强了 AcrIIA4 对 SpyCas9 的抑制作用。上述结构观察结果显示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 竞争性结合 SpyCas9,AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更强的亲和力的实验结果进一步支持了结构观察的结果。接下来的生化实验结果进一步证实 AcrIIA4 结合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 结合 SpyCas9,从而拮抗 SpyCas9 的活性。

非常显着的是,AcrIIA4 的酸性氨基酸 Asp14、Asp37、Glu40、Asp69 和 Glu70 的位置完全与结合 SpyCas9 的底物 PAM DNA 的磷酸主链位置一致,而且上述 AcrIIA4 的氨基酸直接和 SpyCas9 PI 结构域上的 PAM DNA 识别氨基酸 Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335 和 Arg1333 互作。这些结构观察结果揭示 AcrIIA4 通过模拟 PAM DNA 结合 SpyCas9。SpyCas9 蛋白的 AcrIIA4 结合氨基酸在同亚型 N. meningitidis Cas9 (NmeCas9) 中保守,而在不同亚型 II-C Listeria monocytogenes Cas9 (LmoCas9) 中并不保守,从而很好地解释了 AcrIIA4 为什么能抑制 LmoCas9 的活性,却不能抑制 NmeCas9 的活性。

课题组通过进一步结构比较、分析发现,单独 SpyCas9 上并不存在 AcrIIA4 的结合位点,SpyCas9-sgRNA 复合物的形成,使得 SpyCas9 构象发生显着变化,组装形成 AcrIIA4 结合位点,从而很好地解释了本项目初始生化研究结果显示的 AcrIIA4 只结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,而不结合单独 SpyCas9。该结果也和细菌细胞内单独 SpyCas9 是瞬时存在的,而 SpyCas9-sgRNA 复合物是主要存在形式相一致。SpyCas9-sgRNA 复合物形成时,也是噬菌体被细菌 CRISPR 免疫系统“发现”并将被“干扰”之时,因此,这个阶段(SpyCas9-sgRNA 复合物期)是噬菌体抑制细菌的适应性免疫系统(CRISPR-Cas9)的最合适时期。

该研究揭示的 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA4 抑制 SpyCas9 活性的分子机制,不仅对揭示细菌免疫系统(CRISPR-Cas9)与噬菌体防御系统(Anti-CRISPR)“军备竞赛”的共进化分子机制具有重要的科学意义,而且为设计时间、空间特异性地,或条件性地精确控制 SpyCas9 基因编辑活性的工具提供了结构基础。

15.Cell Res:中科院生化细胞所李劲松研究组等建立快速分析致死基因在不同组织中功能的新方法
doi:10.1038/cr.2017.58
2017年4月21日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Cell Research》杂志在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所李劲松研究组和中国科学院神经科学研究所于翔研究组的最新研究成果:“CRISPR-Cas9-mediated genome editing in one blastomere of two-cell embryos reveals a novel Tet3 function in regulating neocortical development”,研究利用CRISPR/Cas9技术和细胞谱系示踪技术对小鼠两细胞胚胎中的单个卵裂球进行了基因敲除,一步法获得了Tet3基因敲除的健康嵌合小鼠,并对Tet3基因敲除后大脑皮层和海马神经元的突触传递进行了探究。该方法是一种快速地分析致死基因在各个组织器官中功能的新方法。李劲松组博士生汪凌波和于翔组博士生李敏寅为本文的共同第一作者,李劲松研究员和于翔研究员为论文通讯作者。

DNA双加氧酶Tet3是Tet蛋白家族的一个重要成员,之前的研究发现, Tet3全身性敲除小鼠有部分可以发育到出生,但是出生后24小时内死亡。因此,若想研究Tet3在成年小鼠中的功能,需要借助Cre/loxP系统在不同的组织中进行特异性的敲除。这就带来一系列的问题:待研究的组织是否有特异性的Cre小鼠资源;若想在不同组织中研究基因的功能,则需要不同的Cre小鼠;条件性敲除小鼠交配周期长。

基于此,李劲松团队提出了一种基于嵌合体的快速分析致死基因潜在功能的方法。首先,他们在mT/mG小鼠胚胎的一细胞时期(受精卵时期)注射了Cas9 mRNA,而后在两细胞时期,随机地在两细胞的其中一个卵裂球注射Cre mRNA和Tet3 sgRNAs。将这些注射过的胚胎移植到假孕小鼠体内,就可以获得Tet3敲除的嵌合鼠,这些嵌合鼠可以正常成活,并且在各个组织器官中都有红色/绿色两种细胞存在,其中红色细胞是野生型,绿色细胞是Tet3敲除的。为简化基因型鉴定同时为保证敲除的成功率,研究人员进一步将多个sgNRAs(3-4个)注射到单个卵裂球中,这种策略得到的小鼠很容易通过PCR条带鉴定出是否有大片段敲除,同时可以把一整个外显子删除掉保证了敲除的成功率。他们对这些嵌合体小鼠的大脑进行分析,发现Tet3敲除并不影响大脑皮层主要细胞类型的发育和分化。研究人员进一步通过对邻近的野生型和Tet3敲除细胞进行成对电生理记录,发现Tet3敲除之后,小鼠大脑皮层和海马锥体神经元的兴奋性与抑制性突触传递均发生了显着性的改变,表现为兴奋性突触传递的上调和抑制性突触传递的下调。研究结果提示Tet3在大脑不同脑区神经环路的发育中起到了重要的作用。(生物谷 Bioon.com)

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