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Science:基于CRISPR/Cas13a的诊断平台可检测任何RNA分子,灵敏度增加一百万倍

来源:生物谷 2017-04-15 18:26


Susanna M. Hamilton/Broad Communications

2017年4月15日/生物谷BIOON/---在一项新的研究中,来自美国哈佛大学-麻省理工学院布罗德研究所(以下简称布罗德研究所)、麻省理工学院麦戈文脑研究所、麻省理工学院医学工程与科学研究所、哈佛大学怀斯生物启发工程研究所(Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering)的研究人员将一种靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相关酶(即Cas13a)改造为一种快速的、廉价的和高度灵敏的诊断工具,从而有潜力引发研究和全球公共卫生变革。相关研究结果于2017年4月13日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2”。

在这项研究中,布罗德研究所成员Feng Zhang、Jim Collins、Deb Hung、Aviv Regev和Pardis Sabeti描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶如何被用作一种高度灵敏的检测器---能够指示最少至一个靶RNA或DNA分子的存在。论文第一作者Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg将这种新的工具称为“SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)”;这种技术可能有朝一日被用来应对病毒性和细菌性流行病爆发、监控抗生素耐药性和检测癌症。

这些研究人员证实了这种方法具有众多应用,包括:
(1)在几小时内检测病人血液或尿液样品中的寨卡病毒的存在;
(2)区分寨卡病毒的非洲毒株和美洲毒株的基因序列;
(3)区分大肠杆菌等细菌的特定类型;
(4)检测抗生素耐药性基因;
(5)鉴定不含细胞的DNA片段中的致癌性突变;
(6)快速从唾液样品中读取人遗传信息,如心脏病风险。

这些研究人员说,鉴于这种工具能够经设计作为一种基于试纸条的测试方法(所使用的试剂不需要在冰箱中储存)加以使用,它非常适合于在传统场所内部和外部(如流行病爆发期间在野战医院,缺乏先进设备的乡村诊所等)快速地部署和广泛地使用。

Zhang说,“激动人心的是,Cas13a酶能够被用来实现这种超乎异常的灵敏度,这对科学和临床医学而言都是强大的应用。这种酶起初是我们与Eugene Koonin合作研究细菌免疫的基础生物学性质时被鉴定出来的。”

在2016年6月,Zhang和他的同事们首次描述了这种靶向RNA的CRISPR相关酶(之前被称作C2c2,如今被称作Cas13a),而且能够经编程后切割细菌细胞中的特定RNA序列(Science, Published online:02 Jun 2016, doi:10.1126/science.aaf5573)。不同于靶向DNA的CRISPR相关酶(如Cas9和Cpf1),Cas13a能够在切割它的靶RNA之后保持活性,而且可能表现出不加区别的切割活性,而且在一系列被称作“附带切割(collateral cleavage)”的作用当中,继续切割其他的非靶RNA。在其发表的论文和申请的专利中,该团队描述了这个CRISPR系统的广泛生物技术应用,包括将它的RNA切割和附带切割活性用于基础研究、诊断和治疗。

在2016年9月发表在Nature期刊上的一篇论文中,美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、Alexandra East-Seletsky和他们的同事们利用Cas13a的这种附带切割活性检测RNA(Nature, Published online 26 September 2016, doi:10.1038/nature19802)。然而,这种方法需要存在几百万个RNA分子,因而缺乏很多研究和临床应用所需的灵敏度。

在这项新的研究中,这种SHERLOCK方法的灵敏度增加了一百万倍。这种增加是由于Zhang团队和布罗德研究所成员Jim Collins合作开展研究取得的结果。Collins之前一直在研究寨卡病毒的诊断方法(Cell, 19 May 2016, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059)。在2014年,Collins和他在怀斯生物启发工程研究所的团队开发出一种快速的基于合成纸的埃博拉病毒测试方法,该方法所使用的试剂能够在室温下运输和储存。他们随后对这种测试系统进行修改来检测寨卡病毒,并且证实他们能够通过加入低水平热量来提高RNA在样品中的浓度来提高这种系统的检测灵敏度。 通过一起合作,Zhang团队和Collins团队能够采用一种不同的依赖体温的扩增过程来提高他们的测试样品中的DNA或RNA水平。一旦这种水平增加,他们利用第二个扩增步骤将DNA转化为RNA,从而使得他们将这种靶向RNA 的CRISPR工具的灵敏度增加了一百万倍,而且这种工具能够在几乎任何环境下使用。

另外,这种CRISPR工具还包括一种RNA报告分子。当该报告分子被切割时,它会发出荧光。当Cas13a检测到靶RNA序列时,它的无区分的RNA酶活性(即附带切割活性)也会切割这种RNA报告分子,从而释放可检测到的荧光信号。

Collins说,“我们如今能够高效地和轻松地让这种工具检测任何核酸分子,当你考虑诊断和研究应用时,它是非常强大的。这种工具所达到的灵敏度能够检测病人血液样品中极其微量的癌症DNA分子,这将有助研究人员理解癌症如何随着时间的推移发生突变。就公共卫生而言,它可能有助研究人员监控群体中抗生素耐药性细菌的数量。这些科学可能性是非常激动人心的。”

这种新的诊断工具的最为迫切的和最为明显的应用之一是在资源贫乏的区域对传染病爆发进行即时诊断。

论文共同作者、布罗德研究所传染病与微生物组项目联合主任Deb Hung说,“这种系统让人感到非常激动人心。不过还需开展大量的研究,但是如果SHERLOCK的全部潜力能够发挥出来的话,那么它可能从根本上改变对常见的和新出现的传染病的诊断。”

论文共同作者Pardis Sabeti说,“SHERLOCK的一种特别强大的优势在于它能够在无需大量复杂的耗时的上游实验工作的情形下开始测试。”鉴于寨卡病毒传染病正在爆发,Sabeti和她的实验室成员一直在收集样品,快速地开展基因组测序,并且分享数据以便加快流行病应对工作。她说,“这种获取原始样品后立即开始加工的能力可能引发寨卡病毒和众多其他传染病诊断变革。这项研究只是刚刚开始。”(生物谷 Bioon.com)

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参考资料:

Scientists unveil CRISPR-based diagnostic platform

CRISPR-Based Nucleic Acid Test Debuts

Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Jeong Wook Lee et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 13 Apr 2017, doi:10.1126/science.aam9321

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