打开APP

理性改造二醇脱水酶使大肠杆菌利用木糖产1,4-丁二醇,减少1,2,4-丁三醇副产物的积累

  1. 二醇脱水酶
  2. 1,4-丁二醇

来源:上海工业生物技术研发中心 2017-02-28 14:10

2017年2月13日,代谢工程杂志在线发表了题为《Rational Engineering of Diol Dehydratase Enables 1,4-Butanediol Biosynthesis From Xylose》的研究成果,研究通过理性蛋白质工程改造二醇脱水酶(Diol Dehydratase

2017年2月13日,代谢工程杂志在线发表了题为《Rational Engineering of Diol Dehydratase Enables 1,4-Butanediol Biosynthesis From Xylose》的研究成果,研究通过理性蛋白质工程改造二醇脱水酶(Diol Dehydratase)使得大肠杆菌产1,4-丁二醇(1,4-BDO),减少了1,2,4-丁三醇(1,2,4-BTO)副产物的积累。

在研究工程中,发现1,2,4-丁三醇脱水反应是整个反应链的瓶颈,于是如何减少1,2,4-丁三醇副产物的积累成为该研究的主题。研究者通过人为合成一条反应链较短的代谢通路(图1)。在本研究中,采用外源表达工程化的二醇脱水酶(来源克雷伯氏菌,Klebsiella oxytoca)来催化1,2,4-BTO的脱水反应。

基于之前的报道,来源于克雷伯氏菌的二醇脱水酶以B12为辅酶,它的天然底物为1,2-丙二醇(1,2-propanediol,1,2-PD),在有C3醇-甘油存在的情况下会失活,在这里,研究者利用它来催化非天然的底物C4醇-1,2,4-BTO。通过蛋白质工程改造的常规套路,对催化活性位点的某些氨基酸替换成分子量较小的氨基酸,这样就可以在"诱导契合"反应下使大的底物进入催化活性位点进行催化反应。

上面提到二醇脱水酶的活性会被甘油所抑制,因为甘油属于三醇,1,2,4-BTO也属于三醇,于是提高二醇脱水酶对三醇(底物)的耐受性成为研究的另一个亮点。根据报道,将301位的丝氨酸(S301)突变成丙氨酸(A301)可以提高二醇脱水酶对甘油的耐受性,经过重复研究证明,将S301突变成A301确实可以提高二醇脱水酶对甘油的耐受性,但是对于催化1,2,4-BTO并没有什么帮助。

根据经验,研究将336位的谷氨酰胺(Q336)突变成丙氨酸(A336),增大了催化活性中心的空间体积,使得该酶可以催化1,2,4-BTO,又通过报道和蛋白质工程的操作手段,将300位的缬氨酸(V300)突变成甲硫氨酸(M300),最终形成了具有三个点突变的酶(S301AQ336AV300M),该酶作用1,2,4-BTO的效果要比野生型的高5倍左右。

上面的工作主要是对关键酶-二醇脱水酶进行蛋白质工程的改造,接下来研究者利用前人研究的基础,在大肠杆菌中构建出一条由木糖到1,4-丁二醇的代谢通路,在研究过程中,研究者首先对木糖到1,2,4-BTO的代谢通路做了优化,最后使得1,2,4-BTO的产量可以高达1506mg/ml。在此基础上,导入之前改造的二醇脱水酶,最终使得1.4-BDO的产量可达到209mg/L。(生物谷Bioon.com)

版权声明 本网站所有注明“来源:生物谷”或“来源:bioon”的文字、图片和音视频资料,版权均属于生物谷网站所有。非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,否则将追究法律责任。取得书面授权转载时,须注明“来源:生物谷”。其它来源的文章系转载文章,本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,转载内容不代表本站立场。不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。

87%用户都在用生物谷APP 随时阅读、评论、分享交流 请扫描二维码下载->