非编码RNA

缩写ncRNA,是指各种不翻译成蛋白质的RNA分子。其中包括rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的 RNA,还包括未知功能的RNA。

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lncRNA研究策略之RNA Pull-down实验问答

来源:生物谷 2017-02-15 10:04

长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子,长度在200bp以上;研究表明,lncRNA具有保守的二级结构,可以与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展,越来越多的lncRNA被注释,但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚,因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域,具有极大的科研价值和意义。其中RNAPull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。

RNAPull-down结合了体外转录与生物素标记、质谱技术,是研究非编码RNA与蛋白质相互作用的一大利器。由于实验程序较多、RNA的易降解性,加上一些不可预知的变量,因此实验存在一些难度,常常导致实验的失败。对于试验中常常出现的棘手的问题,金开瑞经过实践,总结了一套行之有效的应对方策,现在就和我们一起来看看吧!

1、RNAPull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊?

①选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低;

②体外转录得到的RNA降解或者不是全长;

③Pull-down实验孵育时间不长。

④其他

2、PAGE电泳银染背景深?

①样品杂蛋白太多;

②银染显色时间过长。

④其他

3、RNAPull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白:

①选取的RNA序列不对;

②样品中没有表达互作的蛋白质。

③互作蛋白浓度低,银染图肉眼观察不到差异条带。

④其他

更多建议:

①lncRNA序列前期验证要完善;

②选择相应蛋白质表达量较高的组织或细胞样品;

③体外转录选择转录质量高的试剂盒,操作过程避免Rnase的污染;

④保证RNAPull-down实验中探针标记以及探针与蛋白的结合充分进行(依据体外转录RNA的量,样品裂解液蛋白浓度);

⑤尽可能多将洗脱的蛋白电泳(同时可以避免显色时间过长)

好啦,这次就和大家分享这么多啦,如果您在RNAPull-down实验中遇到困惑,可以随时与我们取得联系哦,我们将及时帮您解决!

最后,祝大家实验顺利!生活愉快!

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