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Science:48年谜团终解决!利用人肠道细胞培养物成功地培养人诺如病毒

来源:生物谷 2016-08-30 13:40


2016年8月30日/生物谷BIOON/--人诺如病毒(norovirus)---全世界急性腹泻的主要病毒性病原---很难研究,这是因为科学家们没有发现一种方法在实验室中培养它们。如今,在Albert Kapikian博士鉴定出人诺如病毒是急性腹泻的一种病因40多年后,来自美国贝勒医学院的研究人员首次成功地在人肠道上皮细胞的实验室培养物中培养诺如病毒。这项成果代表着人胃肠炎病毒研究取得一项重大进展,这是因为它建立一种能够培养许多诺如病毒毒株的系统,这将允许科学家们探究和开发新的策略来预防和阻止感染,以及更好地理解诺如病毒的生物学特征。相关研究结果于2016年8月25日在线发表在Science期刊上,论文标题为“Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids”。

论文通信作者、贝勒医学院人类、分子病毒学和微生物学教授Mary Estes博士说,“长期以来,人们一直试图在实验室中培养诺如病毒。在过去的20年里,我们也尝试过。尽管采取过所有的努力,以及成功地培养其他的病毒,但是诺如病毒为何如此难以培养仍然是个谜。”

诺如病毒,也被称作游轮病毒(cruise ship virus),在通常支持其他病毒生长的实验室培养物---如源自癌变组织的转化细胞---中并不生长。此外,诺如病毒是物种特异性的---人诺如病毒只感染人类和导致人类患病,而小鼠诺如病毒只在小鼠体内这样做。人诺如病毒并不在小鼠或通常用于研究的其他小型模式动物体内生长。

Estes说,“我的想法是我们之所以没有成功地培养诺如病毒,是因为我们没有合适的细胞类型。我们首先证实在慢性诺如病毒感染的病人体内,这种病毒能够在被称作肠上皮细胞(enterocyte)的肠道细胞中检测出,但是在培养时,正常的人肠上皮细胞快速地死掉。当我们了解到荷兰的Hans Clevers团队已开发一种方法来制造一种新类型的人肠上皮细胞培养系统(包括肠上皮细胞)时,我们才取得突破。这些新的人多细胞培养物,被称作类肠道组织(enteroid),是由来自病人组织的成体肠道干细胞制作出来的。我们期待将这种病毒放入这些非转化的人细胞培养物中,应会让这种病毒生长。”

论文共同第一作者、Estes实验室高级研究员Khalil Ettayebi博士说,“我在5年的时间里一直与Estes博士一起努力尝试培养这种病毒。我们尝试了很多方法,但是仅获得负面的结果,直到我们开始在实验室中使用这些新的源自人干细胞的类肠道组织培养物。”

这花了Estes和同事们大约1年的时间让这些人肠道上皮细胞培养物在实验室中良好地生长。随后,在利用这些培养物培养诺如病毒之前,他们利用这些培养物试着培养另一种人胃肠道病毒---轮状病毒(rotavirus)。

Estes说,“轮状病毒能够在这些人肠道上皮细胞培养物中生长良好。随后,我们尝试培养人诺如病毒,结果发现一些毒株能够生长,但是另一些毒株不能够。我们猜测仍然有些东西缺失了。”

研究人员通过将自然条件下存在于小肠上段中的物质加入到这些培养物中来试图改善诺如病毒的生长,其中小肠上段是这种病毒生长的自然环境。其他的肠道病毒,如轮状病毒,利用这些物质在体内生长。

论文共同作者、贝勒医学院医学、分子生物学与微生物学教授David Y. Graham博士说,“人体通过分泌来自胰腺的酶和来自肝脏的胆汁到小肠中对摄取的食物作出反应。胰腺酶消化大分子和胆汁让脂肪溶解掉。导致胃肠道炎的病毒,如诺如病毒,利用胰腺酶触发它们复制,但是这些酶对诺如病毒没有影响。我们寻思,如果胰腺酶不重要的话,那么胆汁是允许诺如病毒识别它在哪里和进行复制的一种关键组分吗?”

Estes说,“当我们将胆汁加入到这些培养物中时,之前不能生长的诺如病毒毒株如今大量地生长。”

论文共同第一作者、Estes实验室博士后研究员Kosuke Murakami博士说,“当我们发现胆汁允许人诺如病毒成功地复制时,我最为激动。”

论文共同第一作者、贝勒医学院分子病毒学与微生物学助理教授Sue Crawford博士说,“这种新的培养系统将最终允许我们深入认识这种病毒如何导致疾病。”

Estes说,“我们最终解决了这个持续了48年的古老秘密。我们加入胆汁到这些培养物中,从而能够在模拟肠道环境的培养物中培养诺如病毒。胆汁对几种重要的细菌性致病原而言是至关重要的,但是这是第一次证实胆汁在人肠道病毒复制中起着重要作用。”

这些人肠道上皮细胞培养物是非常独特的,而且研究人员期待这些培养物将允许他们解答重要的问题,比如为何一种诺如病毒毒株能够感染这个人而不会感染另一个人。

Estes说,“这些新的培养物是非常令人关注的,这是因为它们具有小肠不同区域的性质,而且拥有生理学活性。每种培养物是独特的,能够反映建立这种培养物的个人的遗传特征。这允许我们证实一些培养物,如同一些人一样,仅对一种或多种人诺如病毒毒株是敏感的。这些培养物将允许我们确定这种毒株仅限制在一些人而不是其他人体内复制的机制。”

这是首个例子来说明人肠道上皮细胞培养物能够被用来培养一种之前不能够培养的病原体。

Estes说,“我预测通过改变某些条件,这种新的培养系统将允许培养我们此刻不能够培养的其他病毒或细菌。如果我们取得成功的话,那么它将有助开发有效的方法来阻止和治疗感染、测试疫苗、切断传播,以及更好地理解这些微生物如何感染人、对人体防御作出反应和进化。”(生物谷 Bioon.com)

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Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids

Khalil Ettayebi, Sue E. Crawford1,*, Kosuke Murakami1,*, James R. Broughman1, Umesh Karandikar1, Victoria R. Tenge1, Frederick H. Neill1, Sarah E. Blutt1, Xi-Lei Zeng1, Lin Qu1, Baijun Kou1, Antone R. Opekun2,3,4, Douglas Burrin3,4, David Y. Graham1,2,5, Sasirekha Ramani1, Robert L. Atmar1,2, Mary K. Estes

doi:10.1126/science.aaf5211
PMC:
PMID:

The major barrier to research and development of effective interventions for human noroviruses (HuNoVs) has been the lack of a robust and reproducible in vitro cultivation system. HuNoVs are the leading cause of gastroenteritis worldwide. We report successful cultivation of multiple HuNoV strains in enterocytes in stem cell–derived, nontransformed human intestinal enteroid monolayer cultures. Bile, a critical factor of the intestinal milieu, is required for strain-dependent HuNoV replication. Lack of appropriate histoblood group antigen expression in intestinal cells restricts virus replication, and infectivity is abrogated by inactivation (e.g., irradiation, heating) and serum neutralization. This culture system recapitulates the human intestinal epithelium, permits human host-pathogen studies of previously noncultivatable pathogens, and allows the assessment of methods to prevent and treat HuNoV infections.
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