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Nat Commun:利用非同源性DNA片段将CRISPR-Cas9编辑效率提高高达5倍

来源:生物谷 2016-08-20 08:56


2016年8月20日/生物谷BIOON/--CRISPR-Cas9是一种用于在人细胞系中进行基因敲除来发现它们的基因所发挥何种功能的流行技术,但是让基因失去功能的效率存在非常大的差异。

如今,在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员在大多数类型的人细胞中,发现一种方法让CRISPR-Cas9切割靶基因和让它们失去功能的效率提高高达5倍,从而能够更加容易构建和研究基因敲除细胞系以及潜在地作为一种人类疗法让一个发生突变的基因失去功能。相关研究结果于2016年8月17日在线发表在Nature Communications期刊上,论文标题为“Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes”。

科学家们不断发现新的基因或它们编码的蛋白,但是很难发现它们在体内或在疾病中发挥的作用。发现这种作用的关键是让基因失去功能来观察当它被移除时会发生什么。

尽管CRISPR-Cas9能够加快制造基因敲除细胞系的过程,但是人们有时必需制造和筛选许多这种基因编辑器的变异体以便发现哪一种发挥得更好。在这项研究中,研究人员发现只需经过简单调整一下就能够更加有效率地开展这个过程。

关键就是与CRISPR-Cas9分子一起被导入人细胞中的短片段DNA不与人基因组中的任何DNA序列相匹配。这些短片段DNA被称作寡核苷酸,似乎干扰人细胞中的DNA修复机制,从而将比较普通的CRISPR-Cas9的基因编辑效率提高2.5到5倍。

论文通信作者、加州大学伯克利分校创新基因组计划科技总监、分子与细胞生物学兼任助理教授Jacob Corn说,“它表明如果你做了非常简单的事情---只是将廉价的与人基因组不存在任何同源性的人工合成寡核苷酸导入到细胞中,那么基因编辑效率提高多达5倍。”这种技术提高所有CRISPR-Cas9的编辑效率,即便是初始时完全不会起作用的那些CRISPR-Cas9。

利用这种更高的基因编辑效率,研究人员将会更加成功地构建他们想要的基因敲除细胞系,随后利用这些基因敲除细胞系研究一个基因或一组基因的功能。鉴于大多数寿命长的人细胞系起源自癌细胞---包括非常流行的HeLa细胞系,这些细胞系通常含有多于正常时每个基因的两个拷贝。这就使得一次敲除所有拷贝比较困难,因而更高的基因编辑效率会极大地增加这种成功机会。

当通过基因敲除校正人体内的遗传性基因突变时,较高的基因编辑效率也是必不可少的。医生们猜测可将让人们容易患上AIDS等传染性疾病或者自身免疫疾病、炎性疾病或神经退行性疾病的基因敲除掉。Corn和同事们描述的这种方法是否能够用于疾病治疗仍需拭目以待,但是就研究而言,它是非常有效的。

DNA修复是CRISPR-Cas9成功的关键

CRISPR-Cas9分子是由被称作Cas9的蛋白剪刀和一种引导Cas9结合到DNA靶位点并在那里进行切割的向导RNA(gRNA)组成的。这种技术依赖于以下一个事实:当切割靶基因上的特异性DNA序列时,细胞的修复机制并不总是重建这种DNA链,而是在这种DNA序列上产生错误,从而让这种基因失去功能和破坏它的活性。

这种gRNA是一种长20nt的RNA短链,与靶基因上的DNA序列互补。它结合到这种DNA序列上,让Cas9切割这种双链DNA。

为何一些gRNA发挥很好,让Cas9能够将近100%地切割靶基因并让它失去功能,然而其他的gRNA能够结合到靶基因上,但是很少或从不会敲除它?自从这个技术在2012年被来自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和来自瑞典于默奥大学的Emmanuelle Charpentier发明以来,这一直就是个秘。Corn说,这种切割效率随着细胞类型和特定细胞系的不同而发生变化。

Corn猜测Cas9有时较差的切割效率可能与DNA是如何修复的相关联,这是因为DNA修复机制---基本的管家酶修复DNA中的任何可能导致致命性突变的断裂或缺失---在不同细胞之间存在差异。他推断与人基因组不存在同源性的寡核苷酸可能干扰这种修复过程,从而提高基因敲除成功率。

他说,“它给细胞轻轻一击来阻止正常的修复过程发生。”

他将CRISPR-Cas9基因编辑描绘为切割和DNA修复之间的竞争:一旦Cas9进行切割,细胞精确地替换受到切割的DNA,随后Cas9再次切割这种受到替换的DNA,从而陷入一种无尽的切割和修复的循环,直到这些修复酶发生错误,这些基因最终都失去功能。他说,这些寡核苷酸可能会降低这种修复过程的保真度,或者说让细胞切换到一种更加容易发生的修复过程,从而允许Cas9更容易让基因发生断裂。

他说,新的研究方向是试图利用DNA修复的独特性来改善序列插入以便利用一个正常的基因替换一个存在缺陷的基因和可能治愈一种遗传病。(生物谷 Bioon.com)

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Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes

C. D. Richardson, G. J. Ray, N. L. Bray & J. E. Corn

doi:10.1038/ncomms12463
PMC:
PMID:

The Cas9 endonuclease can be targeted to genomic sequences by programming the sequence of an associated single guide RNA (sgRNA). For unknown reasons, the activity of these Cas9–sgRNA combinations varies widely at different genomic loci and in different cell types. Thus, disrupting genes in polyploid cell lines or when using poorly performing sgRNAs can require extensive downstream screening to identify homozygous clones. Here we find that non-homologous single-stranded DNA greatly stimulates Cas9-mediated gene disruption in the absence of homology-directed repair. This stimulation increases the frequency of clones with homozygous gene disruptions and rescues otherwise ineffective sgRNAs. The molecular outcome of enhanced gene disruption depends upon cellular context, stimulating deletion of genomic sequence or insertion of non-homologous DNA at the edited locus in a cell line specific manner. Non-homologous DNA appears to divert cells towards error-prone instead of error-free repair pathways, dramatically increasing the frequency of gene disruption.
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