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PLoS Pathog:利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多种疱疹病毒感染

来源:生物谷 2016-07-02 09:45

2016年7月2日/生物谷BIOON/--大多数成年人携带着多种疱疹病毒。在初始的急性感染后,这些病毒在它们的宿主体内建立终生感染,并导致唇疱疹、角膜炎、生殖器疱疹、带状疱疹、传染性单核细胞增多症和其他疾病。一些疱疹病毒还能够导致人们患上癌症。在潜伏性感染阶段,这些病毒长时间地保持潜伏状态,但是保持偶尔重新激活的能力。这种重新激活有可能导致人们患病。一项新的研究提示着利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术攻击疱疹病毒DNA能够抑制病毒复制,而且在一些情形下,能够导致病毒清除。相关研究结果于2016年6月30日发表在PLoS Pathogens期刊上,论文标题为“CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections”。

CRISPR/Cas9系统靶向结合特异性的DNA序列,诱导靶DNA双链发生精确切割。在哺乳动物细胞中,这样的切割能够被一种被称作非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)的紧急修复系统快速地修复。NHEJ是高效的,但是并不很准确,因而经常导致一些DNA碱基在修复位点上插入或剔除。鉴于每次读取DNA时是按密码子(每个密码子由连续的三个碱基组成)读取的,在关键位点上发生的这些小的DNA序列变化经常破坏相应的基因和它的蛋白产物的功能。

在这项新的研究中,来自荷兰乌德勒支大学医学中心的Robert Jan Lebbink和同事们认为应当能够靶向作用于被感染的人细胞中的潜伏性疱疹病毒DNA并让它们的DNA发生突变,因而潜在地阻止疱疹病毒相关的疾病。为了测试这一点,他们设计出特异性的向导RNA(gRNA),即与疱疹病毒基因组的关键部分互补的且发挥着分子地址作用的短RNA片段。这些gRNA当与CRISPR/Cas9系统中发挥着分子剪刀作用的Cas9结合在一起时,应当能够诱导在疱疹病毒DNA的特定位点上发生切割,随后诱导它们的DNA发生突变,从而破坏这些病毒。

通过采取这种方法,研究人员研究了三种不同的疱疹病毒成员:导致唇疱疹和疱疹性角膜炎的1型单纯疱疹病毒(HSV-1);人巨细胞病毒(HCMV),最为常见的病毒性出生缺陷病因(当这种病毒由妈妈传播给胎儿时);导致传染性单核细胞增多症和多种癌症类型的爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV, 也被称作EB病毒)。

利用被EBV潜伏感染的淋巴瘤细胞作为研究对象,研究人员证实将靶向特异性EBV DNA序列的gRNA导入这些淋巴细胞中能够在特定位点引入突变。这些突变能够破坏EBV病毒的重要功能,并且让病毒DNA分子去稳定化。与此一致的是,研究人员报道利用两种不同的gRA靶向一种HBV必需基因,能够诱导95%以上的EBV基因组从宿主细胞中丢失。

在潜伏性感染期间,HCMV基因组作为环状DNA分子存在于宿主细胞的细胞核中。一旦重新激活,HCMV复制进展缓慢。利用合适的gRNA,研究人员发现CRISPR/Cas9编辑能够高效地破坏HCMV复制。然而,他们也观察到能够逃避CRISPR/Cas9编辑的HCMV变异体出现,这提示着在HCMV基因组多个关键性位点上同时进行基因组编辑是躲避抵抗性HCMV变异体产生所必需的。

相比于HCMV,HSV-1更加快速地增殖。研究人员首先设计出很多种gRNA,然后利用CRISPR/Cas9编辑靶向不同的HSV-1必需基因。他们发现它们中的多种gRNA能够降低HSV-1复制。当将其中的两种gRNA组合使用因而同时靶向两种必需基因时,他们能够完全抑制HSV-1复制。另一方面,在HSV-1潜伏性感染期间,也就是HSV-1 DNA没有活跃地增殖时,他们不能够诱导编辑。

研究人员总结道,“我们观察到将EBV从被潜伏感染的肿瘤细胞中高度有效地和特异性地清除出来,以及破坏HSV-1和HCMV在人细胞中的复制。”他们继续说道,“尽管CRISPR/Cas9并不能够高效地对潜伏性HSV-1进行基因组编辑,但是一旦潜伏性HSV-1重新激活,利用HSV-1特异性的gRNA能够高效地阻止HSV-1复制。”他们希望,他们的结果“可能允许设计出高效的治疗策略靶向潜伏性感染和增殖性感染期间的人疱疹病毒。”(生物谷 Bioon.com)

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CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections

Ferdy R. van Diemen, Elisabeth M. Kruse , Marjolein J. G. Hooykaas , Carlijn E. Bruggeling, Anita C. Schürch, Petra M. van Ham, Saskia M. Imhof, Monique Nijhuis, Emmanuel J. H. J. Wiertz , Robert Jan Lebbink

doi:10.1371/journal.ppat.1005701
PMC:
PMID:

Herpesviruses infect the majority of the human population and can cause significant morbidity and mortality. Herpes simplex virus (HSV) type 1 causes cold sores and herpes simplex keratitis, whereas HSV-2 is responsible for genital herpes. Human cytomegalovirus (HCMV) is the most common viral cause of congenital defects and is responsible for serious disease in immuno-compromised individuals. Epstein-Barr virus (EBV) is associated with infectious mononucleosis and a broad range of malignancies, including Burkitt’s lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, Hodgkin’s disease, and post-transplant lymphomas. Herpesviruses persist in their host for life by establishing a latent infection that is interrupted by periodic reactivation events during which replication occurs. Current antiviral drug treatments target the clinical manifestations of this productive stage, but they are ineffective at eliminating these viruses from the infected host. Here, we set out to combat both productive and latent herpesvirus infections by exploiting the CRISPR/Cas9 system to target viral genetic elements important for virus fitness. We show effective abrogation of HCMV and HSV-1 replication by targeting gRNAs to essential viral genes. Simultaneous targeting of HSV-1 with multiple gRNAs completely abolished the production of infectious particles from human cells. Using the same approach, EBV can be almost completely cleared from latently infected EBV-transformed human tumor cells. Our studies indicate that the CRISPR/Cas9 system can be effectively targeted to herpesvirus genomes as a potent prophylactic and therapeutic anti-viral strategy that may be used to impair viral replication and clear latent virus infection.

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