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Nature:重大发现!史上最简单的CRISPR/Cpf1系统可切割DNA和RNA

来源:生物谷 2016-04-23 08:53

2016年4月23日/生物谷BIOON/--利用CRISPR-Cas9可以非常简单地、多用途地和可靠地修饰多种有机体中的DNA。这是因为自从它的发现以来,全世界的科学家们一直在努力进一步改进或调整CRISPR-Cas9系统以便满足他们各自的特定需要。因此,人们很难想象在不使用CRISPR-Cas9的情形下如何对遗传物质进行基因编辑。

如今,在一项新的研究中,来自德国马克斯普朗克感染生物学研究所、亥姆霍兹传染病研究中心和瑞典优密欧大学(Umeå University)的研究人员描述了酶Cas9的一种潜在替代者---来自土拉热弗朗西丝菌(Francisella novicida)的CRISPR结合蛋白Cpf1---的特征:Cpf1表现出双重切割活性:不仅切割DNA,而且也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是,Cpf1能够独自地对crRNA前体(pre-crRNA,编者注:CRISPR DNA片段经转录而形成的CRISPR RNA前体)进行加工,然后利用加工后产生的crRNA特异性地靶向和切割DNA,因而也就不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶(RNase)和tracrRNA,这是人们迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统。这一发现可能给科学家们提供一种新的序列特异性基因组编辑方法,更为重要的是,还可能便于一次对多种靶位点进行编辑,即所谓的多重编辑。相关研究结果于2016年4月20日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA”。论文通信作者为来自马克斯普朗克感染生物学研究所的Emmanuelle Charpentier。

CRISPR-Cas是细菌免疫系统的一部分,被用来抵抗病毒感染。在CRISPR-Cas9系统中,酶Cas9在病毒DNA靶位点上进行切割,其中这种靶位点是这样确定的:一种被称作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起,形成嵌合RNA(tracrRNA/crRNA),然后,借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对,以这种方式,这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割,也因此这种嵌合RNA也被称作向导RNA(guide RNA, gRNA)。细菌就利用这种工作机制阻止病毒感染。

2011年,Emmanuelle Charpentier和她的同事们描述这个CRISPR-Cas9系统由两种形成RNA双链的RNA分子---tracrRNA和pre-crRNA,其中tracrRNA 对crRNA前体进行加工,让后者变成成熟的crRNA---和蛋白Cas9(之前被称作Csn1)组成的(Nature, 31 March 2011, doi:10.1038/nature09886)。一年之后,Emmanuelle Charpentier和同事们证实tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA, sgRNA)是特异性地引导酶Cas9结合到靶DNA序列上所必需的(Science, 17 Aug 2012, doi: 10.1126/science.1225829)。

从那以后,CRISPR-Cas9被全世界众多实验室所采用。科学家和临床医生都对它抱有巨大的希望。临床医生希望利用它治愈严重的遗传病。

Charpentier说,“尽管CRISPR-Cas9看起来比较简单,但是它的详细作用机制是相当精细的。”在crRNA分子能够将Cas9引导到切割位点之前,初始产生的crRNA前体必须在核糖核酸酶(RNase)的作用下转变成成熟的crRNA,这样功能性的crRNA就产生了。其中一种核糖核酸酶就是RNase III。2011年,Charpentier发现这种酶与tracrRNA一道参与成熟crRNA的产生。

一种最简单的CRISPR系统

如今,研究人员发现发现一些细菌的免疫防御系统在结构上要比CRISPR-Cas9更加简单。除了Cas9之外,这些细菌利用酶Cpf1切割外源DNA。这项研究证实Cpf1能够切割RNA和DNA。Cpf1首先移除crRNA前体的部分序列,辅助后者产生成熟的crRNA。因此,诸如RNase III之类的其他酶是不需要的。成熟的crRNA然后引导Cpf1结合到DNA的靶序列上。

因此,Cpf1具有双重功能:它对crRNA进行加工让后者能够发挥功能,然后在特异性的序列上切割靶DNA。此外,不同于Cas9,Cpf1并不需要tracrRNA分子的帮助结合到靶序列上。因此,它在结构上比CRISPR-Cas9更加简单。Charpentier解释道,“CRISPR-Cpf1是一种即插即用的系统,不再需要其他的组分。相反,在自然环境中,CRISPR-Cas9系统需要其他的助手来加以激活。”

Charpentier说,“考虑到真核生物的基因编辑仍然有待阐明,相比于CRISPR-Cas9系统,CRISPR-Cpf1系统是否够能够提供任何显著的额外益处[,这有待进一步探究]。然而,观察进化是如何成功地产生一种极其简单但又有效的免疫系统抵抗入侵的病毒将是令人吃惊的。可能在未来还有更多这样的系统在自然中发现,对它们的搜索已经在如火如荼地开展。”

另外,我国哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授团队解析出Cpf1结合crRNA时的晶体结构,揭示了CRISPR-Cpf1识别crRNA以及Cpf1剪切pre-crRNA的分子机制,发现Cpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象,crRNA的结合引起Cpf1发生显著的构象变化(详细报道参见新闻:Nature:揭示CRISPR-Cpf1识别crRNA以及剪切pre-crRNA的机制)。(生物谷 Bioon.com)

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The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA

doi:10.1038/nature17945

Ines Fonfara,Hagen Richter, Majda Bratovič, Anaïs Le Rhun & Emmanuelle Charpentier

CRISPR–Cas systems that provide defence against mobile genetic elements in bacteria and archaea have evolved a variety of mechanisms to target and cleave RNA or DNA1. The well-studied types I, II and III utilize a set of distinct CRISPR-associated (Cas) proteins for production of mature CRISPR RNAs (crRNAs) and interference with invading nucleic acids. In types I and III, Cas6 or Cas5d cleaves precursor crRNA (pre-crRNA)2, 3, 4, 5 and the mature crRNAs then guide a complex of Cas proteins (Cascade-Cas3, type I; Csm or Cmr, type III) to target and cleave invading DNA or RNA6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. In type II systems, RNase III cleaves pre-crRNA base-paired with trans-activating crRNA (tracrRNA) in the presence of Cas9 (refs 13, 14). The mature tracrRNA–crRNA duplex then guides Cas9 to cleave target DNA15. Here, we demonstrate a novel mechanism in CRISPR–Cas immunity. We show that type V-A Cpf1 from Francisella novicida is a dual-nuclease that is specific to crRNA biogenesis and target DNA interference. Cpf1 cleaves pre-crRNA upstream of a hairpin structure formed within the CRISPR repeats and thereby generates intermediate crRNAs that are processed further, leading to mature crRNAs. After recognition of a 5′-YTN-3′ protospacer adjacent motif on the non-target DNA strand and subsequent probing for an eight-nucleotide seed sequence, Cpf1, guided by the single mature repeat-spacer crRNA, introduces double-stranded breaks in the target DNA to generate a 5′ overhang16. The RNase and DNase activities of Cpf1 require sequence- and structure-specific binding to the hairpin of crRNA repeats. Cpf1 uses distinct active domains for both nuclease reactions and cleaves nucleic acids in the presence of magnesium or calcium. This study uncovers a new family of enzymes with specific dual endoribonuclease and endonuclease activities, and demonstrates that type V-A constitutes the most minimalistic of the CRISPR–Cas systems so far described.

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