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Science封面文章:确定核孔对称性核心三维结构图

来源:生物谷 2016-04-20 14:00

 
2016年4月20日/生物谷BIOON/--核孔是进入细胞核的通道。一个典型的细胞含有上百个这样的核孔,这些核孔在控制每分钟成百上千个分子进出细胞核中发挥着至关重要的作用。核孔也被很多病毒用来将它们的遗传物质注射进宿主细胞核中,而且已知当细胞发生癌变时,它们发生改变,因此了解它们如何工作是很重要的。
 
在一项新的研究中,来自美国加州理工学院的生物化学助理教授André Hoelz及其研究团队成功地构建出有史以来最为详细的核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)对称性核心的三维结构图,其中NPC控制着哪些分子能够进出细胞中含DNA的细胞核。相关研究结果作为封面文章发表在2016年4月15日那期Science期刊上,论文标题为“Architecture of the symmetric core of the nuclear pore”。
 
核孔是由三层环组成的:面向细胞核的核质环(nuclear ring, 也被称作内环),面向细胞质的胞质环(cytoplasmic ring, 也被称作外环),以及位于这两个环之间的中央孔(central pore)。核质环、胞质环和中央孔组成核孔的对称性核心(symmetric core)。核孔还含有非对称性的结构,如从胞质环向细胞质外延伸的胞质丝(cytoplasmic filament)和从核质环向细胞核内延伸的核篮(nuclear basket)。
这些发现是Hoelz团队过去十多年研究的结果,可能能够导致人们开发出新型的抵抗病毒---它们破坏NPC以便劫持被感染的细胞---的药物从而治疗与NPC功能障碍相关联的多种疾病。
 
Hoelz说,“我们在过去12年开发的方法为解析诸如此类的其他大型的灵活结构打开大门。细胞含有很多类似的复合体,但是很难在原子水平上描述它们的结构。”
 
NPC是包括人类和其他哺乳动物在内的真核生物的细胞内最大和最为复杂的结构之一,而且它在细胞存活中发挥着至为重要的作用。它由大约1000万个原子组成,这些原子一起形成NPC对称性核心及其周围附着到其他细胞复合体上的非对称性结构。NPC拥有的原子数大约是核糖体---一种大型的亚细胞结构,直到2000年,它的结构才被解析出---的50倍。因为NPC如此之大,所以它像一块大的明胶那样摇动,这种持续的运动使得人们很难获得它的明晰结构图片。
2004年,Hoelz为了绘制NPC的结构,制定了一个雄心勃勃的计划:他和他的团队不是试图一次绘制整个NPC的图片,而是确定它的34个蛋白亚基中每个亚基的晶体结构,然后像三维拼图那样将它们拼装在一起。Hoelz说,“很多人告诉我们真地疯了,这永远不会成功,也不可能做到。”
 
去年,Hoelz团队在Science期刊上发表了两篇论文(doi:10.1126/science.aac7420; doi: 10.1126/science.aac9176),详细了描述了NPC内环和外环关键组分的结构,其中这些组分是NPC对称性核心中的两种主要的组分。这种环形的核心嵌入在核膜中,其中核膜是包围着细胞核的双层膜,从而形成一道选择性允许分子进出细胞核的屏障。
 
通过能够将这些通过低温电子断层扫描技术(electron cryotomography)---在这种技术中,立即冻存分离出的完整细胞核,这样它们的结构和分子被封锁在原位,然后利用透射电子显微镜产生二维结构图,而这些二维结构图能够被重组装为三维结构图---获得的晶体结构拼装在一起从而重建完整的人NPC,Hoelz说,“我们首次填补用于提供整体形状的低分辨率电子显微重建图和用于提供所有原子精确定位的高分辨率晶体结构图之间的分辨率差距。”
 
随着这两个关键组分的三维结构已被解析出,绘制NPC对称性核心其他组分的结构图也将会很快完成。他说,“这就像是玩拼图。通过信心十足地放入第一块拼板,我们知道我们将最终能够正确地放入所有的拼板。”
 
正如这篇新的论文中描述的那样,Hoelz团队如今解析出NPC对称性核心的内环(inner ring)中最后剩余的组分的晶体结构,并且确定出在NPC的整体结构中,内环的所有组分在何处组装。
 
为了做到这一点,Hoelz团队不得不首先构建出这整个对称性核心的完整“生物化学相互作用图谱”。这个图谱描述了对称性核心中所有蛋白之间的相互连接和相互作用。NPC对称性核心有19种不同的蛋白亚基。这个构建过程涉及对细菌进行基因修饰来产生纯化的每种蛋白亚基样品,然后每次让两种蛋白亚基放在一个试管内以便观察哪些会彼此之间结合在一起。
 
Hoelz团队然后利用这种构建完成的相互作用图谱鉴定内环中的关键蛋白,并利用X射线晶体分析技术确定这些蛋白中所有原子的大小、形状和位置。X射线晶体分析涉及对晶体样品进行X射线照射,然后分析晶体的衍射图案。研究人员在加州理工学院分子观察台---它的建立得到戈登与贝蒂-摩尔基金会(Gordon and Betty Moore Foundation)的资助---分析了上千个晶体样品,而且是利用来自美国斯坦福同步辐射实验室的自动X射线和来自美国阿贡国家实验室先进光子源的GM/CA光束线进行分析的。
 
论文共同第一作者、Hoelz实验室研究生Daniel Lin说,“我们如今拥有NPC拼图中的关键拼板的清晰结构图,知道这些拼板看起来像什么,也知道它们是如何拼接在一起的。”
 
下一步就是确定这些单块拼板如何拼接成更大的NPC整体结构拼图。为此,研究人员使用了德国海德堡欧洲分子生物学实验室Martin Beck团队2015年发布的人NPC电子显微整体结构重建图(doi:10.1038/nature15381)。Beck团队的这些图片分辨率相对较低,而且也只是对NPC形状的粗略近似,但是它们仍然提供至关重要的框架,而且也正是基于此,Hoelz团队能够将他们利用X射线晶体分析技术获得的高分辨率结构图组装起来。迄今为止,NPC是利用这种方法拼接出来的最大细胞结构。
 
Hoelz说,“我们能够利用我们构建出来的这种生物化学相互作用图谱,以一种不带偏见的方式完成这个拼图。这不仅确保我们的拼板能够拼装到Beck团队的电子显微重建图中,而且就这种相互作用图谱而言,它们也能够拼装在一起也是合情合理的。”
 
Hoelz说,他的团队正致力于确定NPC中剩下的非对称部分的结构,这些非对称部分包括胞质丝和在遗传信息从DNA传递到RNA再传递到蛋白中发挥着至关键性作用的其他细胞复合体,其中胞质丝作为安全地运送分子通过核孔的转运因子的停靠点发挥作用。
 
Hoelz说,“我猜测如今研究进展会非常快。我们确切地知道我们需要做什么。这就像首次攀登珠穆朗玛峰,我们已成功到达4号营地。剩下要做的就是冲刺到峰顶。”(生物谷 Bioon.com)

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Architecture of the symmetric core of the nuclear pore

doi:10.1126/science.aaf1015

Daniel H. Lin*, Tobias Stuwe*, Sandra Schilbach, Emily J. Rundlet, Thibaud Perriches, George Mobbs, Yanbin Fan, Karsten Thierbach, Ferdinand M. Huber, Leslie N. Collins, Andrew M. Davenport, Young E. Jeon, André Hoelz

The nuclear pore complex (NPC) controls the transport of macromolecules between the nucleus and cytoplasm, but its molecular architecture has thus far remained poorly defined. We biochemically reconstituted NPC core protomers and elucidated the underlying protein-protein interaction network. Flexible linker sequences, rather than interactions between the structured core scaffold nucleoporins, mediate the assembly of the inner ring complex and its attachment to the NPC coat. X-ray crystallographic analysis of these scaffold nucleoporins revealed the molecular details of their interactions with the flexible linker sequences and enabled construction of full-length atomic structures. By docking these structures into the cryoelectron tomographic reconstruction of the intact human NPC and validating their placement with our nucleoporin interactome, we built a composite structure of the NPC symmetric core that contains ~320,000 residues and accounts for ~56 megadaltons of the NPC’s structured mass. Our approach provides a paradigm for the structure determination of similarly complex macromolecular assemblies.

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