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DC细胞培养SOP

来源:ThermoFisher 2015-11-06 15:43

一、脐血MNC分离:

1、将脐血袋剪开,分装在50ml离心管中,每管20ml。

2、离心1500rpm,10min。

3、取出上层血浆,送质检部检测病毒和支原体。

4、取出分界处附近细胞,用D-hanks重悬,比例为1:1。

5、在50ml离心管中加入20ml Ficoll淋巴细胞分离液,将上述细胞悬液加到Ficoll分离液上方,分离液与细胞悬液比例为2:3。

6、离心2000rpm,25min,20℃,升速slow,降速off。

7、用移液管吸去上层血浆,小心取出分界处白膜层细胞,分到两个50ml离心管中,每管加D-hanks 40ml重悬。

8、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。

9、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。

10、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。

11、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。

12、离心400g,8min,4℃,升降速调到最大。

13、吸去上清,细胞沉淀用含1% FBS的RPMI-1640培养基重悬,计数后调整细胞浓度为4*106/ml,接种到T175培养瓶中,置孵箱中孵育2h。

二、DC培养:

1、2h后取出培养瓶,镜下观察有细胞贴壁,吸去悬浮的细胞,并加入少量培养基冲洗瓶底两次,将洗液与悬浮细胞混合,计数后离心后用于培养CIK细胞。

2、根据贴壁细胞数(接种细胞总数减去悬浮细胞数),沿瓶口缓慢加入DC无血清培养基,细胞浓度1*106/ml,并添细胞因子DC-5(0.1μl/ml)和DC-6(0.1μl/ml)。

3、第三天加半量培养基,并补充细胞因子DC-5(0.1μl/ml)和DC-6(0.1μl/ml)。

4、第五天进行促熟,加入肿瘤裂解液10-100μg/ml ,孵育24h。

5、第六天加入DC-A(0.5μl/ml),DC-B(1μl/ml),DC-C(1μl/ml),DC-D(1μl/ml),孵育24h。

6、第七天收获的成熟DC细胞,将细胞从培养瓶中吸取到50ml离心管中,并加入D-hanks冲洗瓶底两次,收集细胞。

7、将细胞离心,400g,8min,4℃,升降速调到最大。

8、吸去上清,细胞沉淀加适量D-hanks重悬。

9、离心,400g,8min,4℃,升降速调到最大。

10、吸去上清,细胞沉淀加含10% FBS和CIK-2'(1μl/ml)的RPMI-1640完全培养基重悬到40ml,加入到CIK细胞培养体系中。

三、肿瘤组织消化

1、将手术后取得肿瘤组织于D-hanks中浸泡,清洗表面血污。

2、将肿瘤组织浸于75%酒精中,超声10s。

3、将肿瘤组织浸于含500U/mL双抗的D-hanks中2h。

4、取出肿瘤组织,用D-hanks冲洗后剪碎,放到蓝盖瓶中,加入1倍体积以上的胶原酶NB4(0.2%)和DNase I(5U/mL)消化1-2h。

5、将消化液过滤粗漏,并用适量 D-hanks冲洗滤渣。

6、消化液离心1500rpm,15min。

7、吸去上清,沉淀加适量 D-hanks重悬,过滤300目滤网。

8、离心1500rpm,10min,重复两次。

9、细胞沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬,计数,按1*106/mL的浓度接种到培养瓶中。

10、第二天观察细胞贴壁情况并换液,根据生长情况传代。

四、肿瘤细胞裂解

1、将培养的肿瘤细胞用胰酶消化后,用D-hanks悬浮,浓度为5*106 /ml,加到冻存管中,每管1mL。

2、将冻存管浸于液氮中冰冻(5~10mim)后于37℃水浴使融化,反复冻融5次。

3、冻融后离心300g,10min,收取上清。

4、蛋白裂解液经0.22μm滤膜过滤,测蛋白浓度,冻于-80℃待用。

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