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新发现抗生素先导物可通过核糖开关抑制细菌生长

来源:生物奥秘 2015-11-06 15:07

在筛选一种可阻断细菌生物合成通路的化合物时,研究人员发现了一种抗生素先导物,它以调控RNA结构中的分子交换位点为靶标,使病原体停止生长。

1940-1960年是发现抗生素的黄金时代,而Selman Waksman的研究则宣告了这一时代的到来。这位生物化学家兼微生物学家创造了“antibiotic(抗生素)”这个术语,并率先利用系统筛选来发现抗生素的先导物。在Waksman等人的努力下,他的实验室制备出了20多种天然抗生素,其中最为著名的就是1943年发现的链霉素——治疗肺结核的第一种特效药。这项发现为Waksman赢得了1952年的诺贝尔生理学或医学奖。随之,他的研究受到了美国制药公司默克(Merck)旗下科学家们的关注,他们之间的合作促使链霉素在临床应用上得到了发展。巧的是,最近,来自现默克公司研究实验室的Howe等人阐述了一种新的抗生素先导物,也是用Waksman引入的表型筛选法(只不过进行了精密改良)识别出来的。

在Waksman的研究完成7年之后,原本如潮水般涌现而出的天然抗生素已缩减为涓涓细流。同时,尽管现有的抗生素面临着不断攀升的耐药状况,从而导致临床急需新的药品,但由于各种原因,仅有很少的公司仍活跃在抗生素药物发现的领域。在这种背景下,Howe等人却出人意表地发现了可靶标于细菌非编码RNA(ncRNA)的药物,这可是备受欢迎的喜事!通过阻断代谢通路来确证一种抗生素的存在。a. 当周围环境的核黄素无法利用时,细菌会用一条代谢通路合成核黄素——一种参与多种酶反应的分子。Howe等人通过加入核黄素(可减弱化合物的抗菌作用)来进行识别,从而找出该通路的抑制剂。b. 筛选发现了可选择性抑制核黄素生物合成的合成分子ribocil。据作者报道,ribocil与信使RNA(编码参与核黄素合成的合酶)非编码区域的“核糖开关”调控域结合。核糖开关通常与黄素单核苷酸(FMN,核黄素代谢产物)结合;这种结合诱发核糖开关发生结构性改变,阻止合酶的表达,从而在FMN足可利用时,阻断进一步的核黄素合成。c. Ribocil分子尽管与FMN的结构完全不同,但也能与该位点结合,以“欺骗”开关的方式关闭核黄素的生成,从而使细菌丧失基本的代谢产物。

那么什么是表型筛选呢?它包括将测试化合物置于细菌培养皿中,观察细胞特性(表型)的变化。自Waksman时代以来,最简单的抗生素活性表型筛选一直在追求生长抑制——毕竟细胞死亡是最严重的表型,并能够迅速测定。而Howe等人建立了一种更为灵敏的筛选方法,严密推敲单个细菌的新陈代谢途径。细菌不像人类,它能合成代谢产物核黄素(亦被称为维生素B2),该物质是多种酶反应所需要的辅助因子前体。而这些辅助因子之中,最重要的就是黄素单核苷酸(FMN)。参与核黄素生物合成的基因仅在细菌无法从周围环境获得维生素时,才凸显出其必要性。因此,研究者猜想,如果在细菌培养基中加入核黄素(参与抑制核黄素生物合成途径),那么具有生长抑制效应的抗生素化合物作用就可能受到逆转。于是,他们测试了大约57000个合成小分子,结果确认:一种名为ribocil的分子可通过选择性阻断核黄素生物合成的方式来杀灭细菌。

为了证实ribocil分子的作用机制,Howe等人利用经化合物处理过的细菌(使之完全耗尽核黄素)进行阐述。他们以感染病原菌的小鼠作为研究对象,进行ribocil分子治疗,结果细菌浓度降低了1000多倍,这是一个很有希望的开端。于是,研究小组继续确证ribocil的分子靶标,他们将长期暴露于ribocil(亚致死量浓度下)、已产生耐药性的克隆菌株分离出来,进行基因组测序。人们发现,在细菌基因组的非编码链中存在潜在的变异,导致耐药细菌出现。于是,开始似乎只是常规性的工作马上就变为一件令人兴奋的事情。这表明,ribocil并非抑制某个蛋白质靶标,而是阻断了基因调控的途径。接着,研究者们进一步侦查ribocil的攻击位点,结果发现:在序列的前部有一个高度结构化的ncRNA域,可在核黄素生物合成途径中编码关键合酶的信使RNA上标记翻译的起始位点。

结果表明,ribocil所结合的ncRNA域通常与FMN结合,其位点就是“核糖开关”(riboswitch)——当与配体结合时,其结构发生变化的RNA域(图1b)。当它与FMN结合时,可诱骗核糖开关RNA变成阻止转录和翻译进行的构型,从而阻断合酶的表达。该机制为减少细菌进一步产生核黄素提供了一条途径,因而,FMN在辅助因子足够量的情况下是有效的。而Ribocil正是与同一ncRNA靶标相结合,才能“欺骗”核糖开关发生应答,从而关闭核黄素的合成,使细菌丧失最基本的代谢产物。为了找到一个强有力的证据,研究者用X射线晶体照相术为ribocil分子拍了一张快照,显示其与核糖开关RNA结合的作用。这种结构性信息对于改进具有临床应用潜力的ribocil分子衍生物的抗菌活性很有价值。

不过,这种模仿核糖开关天然配体的机制在其它任一抗菌化合物中均未发现。因此,研究只是总结性地阐述了表型筛选的优势,即促使一条通路的所有组成部分——包括蛋白质与核酸——都在公平的方法下同时进行测试。尽管核糖开关明显是抗生素发现的靶标,但Howe等人首次证实了有一种能与核糖开关结合的分子存在,且并不是与代谢产物配体十分类似的结构。这缓解了ribocil在其它通路(包括核黄素和FMN)缺乏关闭目标效应的囧况(已在作者的观察中有所提示:即便是高剂量的化合物也对小鼠没有毒性作用)。

从更广阔的视角来看,Howe等人的研究令人瞩目地阐述了ncRNA中的结构域可能是合成药物的靶标。而此前只有很少有关ncRNA部分可用作潜在药物靶标的例证,其中一个可被称为“域”的例证是丙肝病毒,可与合成的病毒蛋白合成抑制剂相结合。不过,其实许多天然抗生素是通过靶标细菌核糖体(合成蛋白质的细胞器)的ncRNA部分来干扰蛋白质合成,进而起效的。

乐观的研究者猜测,自然通过靶标核糖体中的ncRNA来起到某种重要作用,因而可能会认为,目前在细菌以及更为复杂的微生物的基因组中发现过多的ncRNA,这将会为治疗性干预提供丰富的靶标。而对于持怀疑态度的人们,Howe等人的工作也可能减少他们对以ncRNA部分作为靶标是否可能助生新药的怀疑。我们希望,亟需替代性抗生素的临床医师将会成为首批享受到新兴药物靶标——RNA——好处的受益者。(生物谷Bioon.com)

原文检索:Thomas hermann. (2015) Antibiotic tricks a switch. Nature, 526, 650-651.

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