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浙江大学、中国疾病预防控制中心、中科院微生物所联合发表脑蛋白质组研究成果

来源:Orbitrap组学俱乐部 2015-08-10 11:56

浙江大学、中国疾病预防控制中心、中科院微生物所的学者,使用脑组织样本,对朊病毒相关疾病进行了蛋白质组学研究。此研究工作作为编辑推荐论文,发表在今年4月出版的Mol Cell Proteomics (Proteomics analyses for the globalproteins in the brain tissues of different human prion diseases)。

实验使用患库贾氏症(sCJD)、致死性家族失眠症(FFI)、 G114V遗传库贾氏症(G114V)三种传染性海绵状脑病人以及正常人的脑皮质组织和小脑组织。人脑顶叶及小脑区域组织与PBS缓冲液 1:10混合后匀浆。研磨产生的组织碎片通过低速离心(2000 g, 10 min)去除,收集上清。蛋白质浓度通过BCA法(bicinchoninic  acid  method)测定。之后蛋白保存在-80°C。实验时,100微克蛋白样品与TEBA溶液混合,使各样品达到相同体积。之后按每100克蛋白样品, 3.3克胰蛋白酶的比例加入胰蛋白酶,以进行酶切。TEAB溶液中的蛋白样品在 37 °C 下酶切 24小时后,按比例再加入1克胰蛋白酶,再在 37 °C下继续酶切12小时。之后使用SpeedVac离心浓缩系统去除溶剂。酶切产生的肽段使用稳定同位素标记。其中,不同的样品来源的肽段使用不同质量的稳定同位素质量标签,以便在样品混合后,通过标签质量差异来区分蛋白信号来源。标记好的肽段进行混合,混合肽段经过高pH反相和强阳离子交换色谱色谱(SCX)分级后,使用Orbitrap型质谱系统进行蛋白的鉴定和各样品间同种蛋白的相对定量分析。 pathies, TSEs)以及正常人的脑皮质组织和小脑组织。人脑顶叶及小脑区域组织与PBS缓冲液 1:10混合后匀浆。研磨产生的组织碎片通过低速离心(2000 g, 10 min)去除,收集上清。蛋白质浓度通过BCA法测定。之后蛋白保存在-80°C。实验时,100微克蛋白样品与TEBA溶液混合,使各样品达到相同体积。之后按每100克蛋白样品, 3.3克胰蛋白酶的比例加入胰蛋白酶,以进行酶切。TEAB溶液中的蛋白样品在 37 °C 下酶切 24小时后,按比例再加入1克胰蛋白酶,再在 37 °C下继续酶切12小时。之后使用SpeedVac离心浓缩系统去除溶剂。酶切产生的肽段使用稳定同位素标记。其中,不同的样品来源的肽段使用不同质量的稳定同位素质量标签,以便在样品混合后,通过标签质量差异来区分蛋白信号来源。标记好的肽段进行混合,混合肽段经过高pH反相和强阳离子交换色谱色谱(SCX)分级后,使用Orbitrap型质谱系统进行蛋白的鉴定和各样品间同种蛋白的相对定量分析。

结果中共鉴定到2287种蛋白,与正常脑组织和小脑组织相比,传染性海绵状脑病的小脑组织样本中发生蛋白含量变化的蛋白种类要多于皮质。其中在病变的小脑组织中,分别有161和151种蛋白发生上调和下调,分别占总鉴定蛋白种类的7.0%和6.6% ;在病变的皮质组织中,分别有348和379 种蛋白发生上调和下调,分别占总鉴定蛋白种类的15.2%和16.6% 。合并小脑与皮质结果,共发现了病变组织中727种蛋白上调和312种蛋白下调。

研究者对发生表达变化的蛋白,使用基因本体(Gene Ontology, GO) 分类系统进行了分类(GO分类)。在库贾氏症、 致死性家族失眠症、G114V遗传库贾氏症三种传染性海绵状脑病结果中,根据细胞组分分类排名前五的分别是 cell part, cell, membrane-bounded organelle, intracellular和organelle;而根据分子功能分类,前5种功能分别是binding, protein binding, ion binding, catalytic activity 和 adenylnucleotide binding 或cation binding;根据生物过程分类,最多的5种功能是cellular process, metabolic process,  response  to stimulus,  cellular  metabolic process和 macromolecule  metabolic process。(生物谷Bioon.com)

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Proteomics Analyses for the Global Proteins in the Brain Tissues of Different Human Prion Diseases*

DOI:10.1074/mcp.M114.038018

Proteomics changes of brain tissues have been described in different neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease and Parkinson's disease. However, the brain proteomics of human prion disease remains less understood. In the study, the proteomics patterns of cortex and cerebellum of brain tissues of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, fatal familial insomnia, and G114V genetic CJD were analyzed with isobaric tags for relative and absolute quantitation combined with multidimensional liquid chromatography and MS analysis, with the brains from three normal individuals as controls. Global protein profiling, significant pathway, and functional categories were analyzed. In total, 2287 proteins were identified with quantitative information both in cortex and cerebellum regions. Cerebellum tissues appeared to contain more up- and down-regulated proteins (727 proteins) than cortex regions (312 proteins) of Creutzfeldt-Jakob disease, fatal familial insomnia, and G114V genetic CJD. Viral myocarditis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, lysosome, oxidative phosphorylation, protein export, and drug metabolism-cytochrome P450 were the most commonly affected pathways of the three kinds of diseases. Almost coincident biological functions were identified in the brain tissues of the three diseases. In all, data here demonstrate that the brain tissues of Creutzfeldt-Jakob disease, fatal familial insomnia, and G114V genetic CJD have obvious proteomics changes at their terminal stages, which show the similarities not only among human prion diseases but also with other neurodegeneration diseases. This is the first study to provide a reference proteome map for human prion diseases and will be helpful for future studies focused on potential biomarkers for the diagnosis and therapy of human prion diseases.

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