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GE Healthcare:使用两种动态的GFP感受器进行细胞周期的siRNA筛选

来源:生物在线 2008-09-08 00:00

M. Kenrick, S. Hancock, S. Stubbs, and N. Thomas
GE Healthcare, The Maynard Centre, Cardiff, UK
 
 
近来关于siRNA技术和诸如IN Cell Analyzer的高通量成像分析平台的发展对于基因组和蛋白组的功能分析起着革命性的推动作用。在此,我们将会介绍两种能够稳定表达绿荧光蛋白(GFP)细胞周期感受器的细胞株在筛选siRNA分子库中的应用,这种筛选得到的分子库将被用于抑制细胞周期的核心调控基因。通过全自动的图像分析系统对这两种细胞株的中GFP荧光强度和分布状态进行成像检测,得到荧光在细胞周期各个过程中的分布,该结果能够帮助科学家筛选通过封闭细胞周期起作用的药物。   
 
介绍
 
合成和病毒编码的siRNA技术已经发展到了一个新的高度(1, 2),大量的RNAi筛选已经能应用于哺乳动物细胞 (3–5)。除了保证有大量有效的siRNA外,高效的哺乳动物siRNA功能筛选更加需要高信息含量的系统模式,从而使实验数据中能够提取的多重参数通量水平和巨大的研究课题数量相一致。
 
可喜的是,荧光成像系统和分析软件的发展已经跟上了siRNA的发展速度,目前的技术已经能够对活细胞形态发生进行高通量的成像和分析(6, 7)。相应的仪器能够通过整合荧光细胞感受器和细胞形态学的数据,提供在细胞筛选中siRNA的详细表性变化信息,从而对复杂多变的生物系统进行研究。
 
在本研究中,我们研究了两种能够稳定表达绿荧光蛋白(GFP)细胞周期感受器的细胞株(8–10),它们能被用来筛选抑制细胞周期核心调控基因的siRNA分子库(图 1)。
 
siRNA 筛选
 
使用包含112个siRNA库的Dharmacon siARRAY™对细胞周期基因进行敲除,其中每个库都包括了能够抑制单一细胞周期相关基因4种siRNA,并把随机编码和用Cy™5标记的siRNA作为对照以确定转染效率。siRNA转染至G2/M和G1/S细胞周期阶段标记(Cell Cycle Phase Marker ,CCPM)的细胞并于U2OS细胞表达。实验方法的详细描述可参考本文的完整版。
 
细胞成像使用GE Healthcare的IN Cell Analyzer 1000,20倍物镜,475BP20/535BP50 (GFP) 和
620BP60/700BP75 (DRAQ5) 激发/散射滤光片。得到的图像数据被转换成IN Cell Analyzer 3000的数据格式,并通过图像对细胞数目、细胞周期分布和细胞形态学进行了分析。
 
结果
 
通过对G1/S CCPM细胞的分析,得到了在G1至S期过程中,敲除剪切型细胞周期调节因子cyclin E的影响性的精确定量。对照的G1/S CCPM细胞表现出的可分解的细胞比率(76%)和对照的G2/M CCPM细胞相一致(74%),其中9%为G1期细胞,67%为S期细胞。敲除了cyclin E后,在G1和S期的相关细胞总体比率仍旧维持在76%,同样的结果也在G2/M CCPM细胞中被观察到。然而,值得注意的是这两个时期之间的平衡却发生了变化,G1期细胞升高至27%,S期细胞降低为49%,这揭示了cyclin E在细胞从G1期向S期转变过程中的作用。
 
先前的研究表明,用siRNA敲除polo-like激酶(PLK)能够抑制细胞增殖,使细胞停留在有丝分裂阶段,并且诱导细胞凋亡(11)。用抑制PLK的siRNA处理G2/M CCPM细胞并进行细胞周期分析,发现用50 nM siRNA转染48小时后,有丝分裂的细胞数目发生了明显的增加(图3B)。通过对G1/S CCPM (图3A) 和G2/M CCPM(数据未给出)的分析证实了细胞对PLK被敲除后的极度敏感性,在5 nM siRNA处理下,G2和M期的细胞数量发生了增长,相应的,G1期细胞数量发生了下降。
 
使用DNA粒度对所有通过siRNA库筛选得到的图像数据进行再次分析,结果表明PLK siRNA在本研究中对于敲除基因从而诱导凋亡的过程起着最为重要的作用(图3C)。  
 
结论 
 
--通过siRNA对敏感和动态的细胞表型研究进行干扰,为细胞周期的功能分析提供了强有力的工具。
--高通量亚细胞成像和全自动多重参数图像分析为筛选和研究siRNA的基因敲除作用提供了一个高内涵的分析环境。


图1. G2/M 和 G1/S 细胞周期阶段标记(CCPM)构建和细胞株. 在设计好的细胞周期对照及应答原理的调控下,GFP融合蛋白的表达、定位和降解为在活细胞的周期中定位蛋白提供了可能。cyclin B1启动子在S期晚期启动EGFP表达,并由此调控表达G2/M CCPM。当细胞周期到达G2期时,细胞质中的EGFP信号强度增长,而细胞周期早期荧光信号主要集中在核上。GFP信号在有丝分裂期强度达到最大值,随即由于cyclin B1破坏盒(D-box)的调控而迅速下降,于是在下面的2个G1期子细胞上就得不到荧光信号。G1/S CCPM通过泛素C启动子的作用而表达,在整个细胞周期中GFP融合蛋白的表达水平都较低。在G1期,融合蛋白大都位于细胞核中,在进入S期过程中,PSLD区域的磷酸化作用介导蛋白向细胞质中转运,从而在G2期整体改变了融合蛋白在细胞核/细胞质中的分布。


  
 

图2. Cyclin E siRNA阻断了G1期向S期的变化。用直接抑制cyclin E的siRNA pool转染G1/S CCPM细胞,经过24小时后,以BrdU刺激细胞1小时,通过细胞增殖荧光法检测BrdU的整合作用。G1和S期的细胞通过用目标密度图像分析进行数量测定。G1期细胞为绿色,S期细胞为红色。

  
 

图3. 以PLK siRNA阻断细胞周期并诱导凋亡。(A)5 nM PLK siRNA 转染G1/S CCPM细胞,孵育24小时后加入BrdU。(B)50 nm PLK siRNA转染G2/M CCPM细胞并孵育48小时。(C)对于所有使用的siRNA,通过检测DNA的粒度来检测细胞凋亡。

参考文献
1. Kumar, R. Conklin DS, Mittal V. High-throughput selection of effective RNAi probes for
gene silencing. Genome Res. 13 (10), 2333–2340 (2003).
2. Luo, B. et al. Small interfering RNA production by enzymatic engineering of DNA
(SPEED). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (15), 5494–5499 (2004).
3. Berns, K. et al. A large-scale RNAi screen in human cells identifies new components of
the p53 pathway. Nature 428 (6981), 431–437 (2004).
4. Paddison, P.J. et al. A resource for large-scale RNA-interference-based screens in
mammals. Nature 428 (6981), 427–431 (2004).
5. Mousses, S. et al. RNAi microarray analysis in cultured mammalian cells. Genome
Res. 13 (10), 2341–2347 (2003).
6. Ramm, P. and Thomas, N. Image-based screening of signal transduction assays.
Sci. STKE. (177), (2003).
7. Price, J.H. et al. Advances in molecular labeling, high-throughput imaging and machine intelligence portend powerful functional cellular biochemistry tools.
J. Cell. Biochem. Suppl. 39,194–210 (2002).
8. Thomas, N. Lighting the circle of life: fluorescent sensors for covert surveillance of the
cell cycle. Cell Cycle 2 (6), 545–549 (2003).
9. Thomas, N. et al. Characterization and gene expression profiling of a stable cell line
expressing a cell cycle GFP sensor. Cell Cycle 4 (1), 191–195 (2005).
10. Gu, J. et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes
in DNA damage foci. Mol. Biol. Cell. (7), 3320–3332 (2004).
11. Liu, X. and Erikson, R.L. Polo-like kinase (Plk)1 depletion induces apoptosis in cancer
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (10), 5789–5794 (2003).



关于 GE Healthcare 的 IN Cell Analyzer

IN Cell Analyzer 是运用了当今最先进的模块化快速自动成像技术的高内涵活细胞分析系统,其高度灵敏的成像技术使得科学家们能够轻松地研究细胞变化过程中的真实生物学进程,目前,该技术已经被广泛应用于基础研究和药物发现领域。该系统将高通量的自动显微镜技术、在线自动加样技术和在线细胞培养技术完美整合,是当前功能最强大、应用最广泛、设计最灵活、操作最简便的高内涵细胞分析系统。其主打机型IN Cell Analyzer 1000 获得全球权威咨询机构Frost & Sullivan颁发的2007年细胞分析领域 - 技术革新奖。希望获取更多信息,请访问http://www.gehealthcare.com/incell。
 

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