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体外病毒测试方法:细胞基质检定 Cell Substrate Characterization

来源:生物谷 2013-09-02 15:03

全球各国监管当局,如美国食品药品管理局FDA和欧洲药品评估局EMEA针对生物药及疫苗生产过程中的微生物污染和杂质限度发布了严格的限制法规。这些法规确保了产品的无菌和病人的安全。为确立测试方法的准确性,各监管当局要求生产企业在临床试验被批准前及生物药和疫苗终产品释放前,完成验证测试。因此,生产流程的各个环节都必须通过繁复的安全测试以证明产品的一致性、稳定性及纯度。

生产流程的每个阶段表现为其间的各种测试,包括细胞基质库(cell substrate bank)、毒种库(viral seed banks)、动物来源的原辅料、原液和临床试验产品批次。特别是原料测试中包含的主细胞库(Master cell bank, MCB)、工作细胞库(Working cell bank, WCB)、达到培养代次上限的细胞(Cells at the limit, CAL)、最终生产细胞(End of Production, EPC)、主病毒种子库(Master virus bank/Seed)、工作病毒种子库(Working virus seed bank)、未纯化原液(non-purified harvest)、纯化后原液(purified harvest)及临床批(clinical lot)(图1)。这些测试都是依照国际协调会议(ICH)指导原则、FDA疫苗指导原则2010版及欧洲药典进行。未感染的对照细胞(non-infected control cells, CC)也会被收获并随同生产流程相关的其他原料一同测试。将未感染的对照细胞涵盖在测试步骤中能提升检测外来因子的能力(见表1)。值得忧虑的是,用于生物制药的细胞基质有可能被内源病毒感染。有时,细胞基质在生产过程中被病原微生物所污染,如各种病毒、细菌及支原体。表1及表2所列出的测试策略就是用于检测生物药物生产过程中的潜在的污染物。生产工艺(包括原辅料的病毒风险评估和临床应用)确定了合适的测试类型用于保障生物制剂的纯度,并能通过监管机构的审查。

图1 图示病毒疫苗生产的测试流程(真核细胞培养)

 

体外细胞培养感染力鉴定法(INFECTIVITY ASSAYS)

感染力鉴定法常用于筛选感染性病毒污染物的存在。这些非特异的体外测试用于大范围的病毒检测。尤其,病毒感染指示细胞的能力是通过细胞病理(cytopathology)学或者血球吸附试验(Haemadsorption)体现出来。该测试不用于病毒感染的定性及定量。

表1 细胞基质(疫苗类)鉴定一览

尤为重要的是,这些体外测试必须使用生产人/畜用产品的细胞株来测试。测试的精密性依赖于细胞库的来源、可能存在的病毒类型、产品用途及监管机构的要求。

关于人用产品的检测,主要是检测能感染人的病毒。例如,ICH Q5A指导原则建议使用易感于人类病毒的人或非人的灵长类细胞作为指示细胞。同样的,1993年及1997年的FDA《考虑要点》(Points to Consider)推荐至少使用3种细胞(如果可能,需要同种属相同组织来源的生产株,如人二倍体细胞和猴肾细胞)。

为确保培养周期,《指导原则》指出至少2周的培养时间后再观察;血球吸附试验须在观察结束后进行。如果细胞培养基能支持巨细胞病毒的生长,1993年的FDA《考虑要点》推荐至少需要4周的人二倍体细胞培养周期。延长细胞培养周期能提高缓慢生长病毒的检测灵敏度。因此,使用除人二倍体细胞外别的指示细胞,来建立长于28天的体外检测能提供更高灵敏度的外来病毒污染的测试方法。

大多数细胞培养系统历史上暴露于、或者要求使用一些牛或者猪源的材料,监管机构要求建立特异性的细胞培养测试方法。例如,美国联邦法规(Code of Federal Regulation)第九篇要求在免疫荧光法检测特异病毒后,再用规范的细胞基础的培养系统检测外源因子。这个测试能十分可靠的指明样品是否被以下病毒感染:牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛细小病毒(Bovine parvovirus, BPV)、牛腺病毒(Bovine adenovirus, BAV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、呼肠弧病毒(Reovirus, Reovirus)、狂犬病病毒(Rabies virus, Rabies)、牛副流感3型病毒(Bovine parainfluenza virus, BPI3)、猪腺病毒(Porcine adenovirus, PAV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating ence-phalomyelitis virus , PHEV)及传染性胃肠炎病毒Transmissible gastroenteritis virus (TGEV)。这些测试使用广泛易感不同病毒的牛鼻甲细胞(BT cell)、猪及猴肾细胞(Vero)。这些细胞将与样品一起孵育21天。至少14天后才可从孵育的细胞中分离出单层细胞(monolayers)用于终点分析。按照美国联邦法规第九篇的要求可以使用免疫荧光法、血球吸附试验和细胞学染色分析。同培养基一同培养的牛鼻甲细胞、猪及猴肾细胞作为平行阴性对照。

表2 CHO细胞基质鉴别一览

透射电镜分析法(TEM)

透射电镜法是作为检测细胞基质及发酵罐扩大生产的内源、外源致病因子的补充办法。透射电镜提供了一个直接地、可视化地观察病毒或者类病毒颗粒的办法。同感染力鉴定法类似,透射电镜法也是一种非特异的方法,可以补充检测一些体外、体内及分子检测技术检测不到的病原因子。监管机构推荐将透射电镜应用于:a. 检测和定量病毒及类病毒颗粒,b. 病毒、细胞及载体检定。在检测细胞基质时,法规指导原则建议在记录细胞形态观察后,至少观察200个细胞以判定是否有病毒、逆转录病毒的感染。透射电镜负染法(negative staining)对不染色的污染物如支原体、酵母、细菌和病毒特别有效。负染法也应用于啮齿类动物细胞发酵、下游纯化前逆转录病毒载量的监控。

逆转录病毒试验(RETROVIRUS ASSAYS)

用于生产生物产品、疫苗或者载体的细胞基质需要通过透射电镜、感染力鉴定和逆转录酶试验来测试是否有逆转录病毒的污染。大部分细胞含有内源的逆转录病毒或者类逆转录病毒序列,有些细胞(如鼠细胞)有可能是逆转录病毒的来源。指导原则要求使用透射电镜分析法和感染力鉴定法来证明未加工的原液(unprocessed bulk)、主细胞库(MCB)及达到体外传代数的细胞未感染逆转录病毒。特异性的感染力鉴定试验是依据预计的逆转录病毒污染设计、进行的。初始低滴度的逆转录病毒感染的确认,可以通过使用合适的测试方法,用高度易感的细胞株多次传代而获得。待测细胞可以同指示细胞共培养(co-cultivation assays),或者直接使用细胞上清或细胞悬液感染指示细胞。针对鼠逆转录病毒,通常使用成纤维细胞Mus Dunni Cells来扩增,因其对大部分鼠白血病病毒(Murine Leukemia Viruses, MLVs)高度易感(除了嗜亲性Moloney鼠白血病病毒)。在这些测试中,样品将被接种到Mus Dunni细胞中,至少培养14天或至少3代。然后收集细胞上清用斑点形成实验S+L-法测试,证明感染性逆转录病毒是否存在。S+L-实验是将待测的培养上清接种在PG4细胞上,观察逆转录病毒形成斑点。

XC空斑试验是用于特异性检测嗜亲性鼠白血病病毒(eMLV)。鼠胚胎细胞系SC-1被有代表性地用做测试细胞系。SC-1细胞被接种到待测样品中,传代并扩增低水平感染的病毒。然后将培养物铺在XC细胞上,而后形成多核细胞(合胞体细胞,syncytia)。

直接或扩展的S+L-试验分别用猫或者貂细胞系检测兼嗜性(amphotropic)或嗜异性(xenotropic)逆转录病毒。这些病毒因能使含缺陷型肉瘤病毒回复突变而使S+L-细胞变形而被检测到。逆转录病毒的定量可通过计算变圆的细胞数目而得出。扩展的S+L-试验是使用多次传代来扩增病毒以提高灵敏度,用以改善直接S+L-法检测低水平逆转录病毒感染时不一定能检测出来的问题。

除了感染力鉴定实验外,知道原则推荐将逆转录酶(reverse transcriptase)活性作为细胞外逆转录病毒颗粒和逆转录病毒感染的标志物。当逆转录病毒和逆转录酶存在时,逆转录酶试验(在文献中表述为Amp-RT, PBRT或者PERT)能检测RNA模板到cDNA的转化。开发的这些逆转录酶依赖的测试方法主要使用定量荧光产物增强逆转录病毒逆转录酶(QF-PERT)测试细胞库及来自人或者禽的病毒疫苗产品。

QF-PERT可以检测所有感染性的逆转录病毒,每种逆转录病毒编码一个具有功能的逆转录酶。另外在QF-PERT试验中,含有细胞DNA聚合酶抑制物能减小假阳性。将QF-PERT和超速离心富集病毒颗粒相结合能提高逆转录酶活力检测的灵敏度,并根据每个样品的特质做测试的优化。需要测试的原料包括细胞基质、病毒种子、和/或者由哺乳动物细胞生产的病毒疫苗。

感染力鉴定试验(Infectiveity Tests)可以同灵敏的QF-PERT测试终点相结合。对于非鼠源的逆转录病毒,推荐使用经挑选的、对不同逆转录病毒毒株易感的合适的指示细胞。在一些细胞中可能潜在一些内源性的逆转录病毒序列,将这些细胞用于生产活病毒疫苗,或当下游不纯化去除或者灭活逆转录病毒,将可能引发问题。因此,当细胞在常规状态下培养时,用透射电镜法(TEM)和定量荧光产物增强逆转录病毒逆转录酶(QF-PERT)法检测细胞基质,可能出现假阴性结果。在一些情况下最好使用化学试剂激活内源的或潜伏的逆转录病毒。随后使用广泛易感的细胞株共培养或者使用遗传试验来证明没有感染病毒,必要时可以协同F-PERT和TEM一起测试。

种属特异的实时定量PCR法(REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION, RT-PCR)

挑选那些病毒做测试需要考察细胞生产株的来源及历史、病毒疫苗种子(virus vaccine seed)的特质、生产过程中使用的原辅料。例如,当使用含人或灵长类动物来源的材料生产时,大范围的人类病毒PCR测试是必须的。需要人类病毒PCR测试的包括人杂交瘤(hybridomas)、干细胞(stem cells)及其他细胞系(如MRC-5, VERO, HEK293和PER.C6),还有就是所有的用于生产腺病毒载体/疫苗的材料。

对于有些不易在培养过程中检测的病毒,PCR法是最为有效的工具。当遇到与严重的或者致癌疾病相关的人类病毒时,筛选(screening)是非常有必要的,特别是能引起潜伏(latent)或者流产性复制(abortive replication)的病毒。欧洲监管当局鼓励一些流感疫苗生产商针对一些特定的呼吸道病毒做PCR测试。当使用蛋或者含禽源的细胞基质培养的流感病毒,推荐做外源性禽病毒PCR测试。其他不能使用基于细胞的测试方法的,将使用大量的RT-PCR检测外源风险因子。CHO细胞高度易感于小鼠细小病毒(Minute Virus of Mice),MVM已经在日常生物药生产过程中引起原液的污染。实时PCR(RT-PCR)能提供一个高效的细胞基质、原液病毒感染的排除机制。

在2010年,记录在案的有猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)的污染事件。一种新的,被RT-PCR法验证的,称为大规模平行测序法(massive parallel sequencing, MPS)或者称为深度测序法(deep sequencing)的技术用于检测葛兰素史克(GlaxoSmithKline)轮状病毒疫苗生产的PCV病毒污染。圆环病毒活力强,很难被包括伽马射线的理化方法灭活。研究表明,人类或者灵长类细胞容易感染猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、Ⅱ型(PCV-2)。PCV-1的感染已经在Vero细胞、HEK293细胞、Hela细胞培养物中被发现。同时PCV-1病毒不会引起细胞形态变化,而PCV-2能引起细胞形态变化。

在2010年的污染事件中,大部分都是因为在生产中使用了被污染的胰蛋白酶(trypsin)。因为大部分细胞都会暴露于胰酶下,监管部门要求筛选所有用于临床生产的细胞基质。其他一些病毒也已经在被关注,包括最新发现的胡可病毒(hokoviruses)和肝病毒(hepatitis viruses),RT-PCR法是最为合适的检测方法。

因PCR法的高特异性,一般会同时平行做多重PCR测试来确认所有可能的病毒种类。法规指导原则推荐在设计PCR实验时使用退化的或者简并引物来检测样品,以此来提供高灵敏度的测试以保证产品的安全性。

结论

总所周知,细胞基质或者同细胞生长相关的要素能引入污染物,因而由此而生产的生物制品及生产过程中的病毒污染备受关注。病毒污染物可被带入到细胞株中、细胞培养用的原料、环境、人员、仪器或者其他各方面。检测病毒有不同的测试策略,测试方法可以是专一性的(测试病毒的存在但不定性)或者非专一性的(测试病毒的存在且定性)。尤为重要的是需要关心病毒的存在(特别是潜伏病毒或致瘤病毒)及在生物药物原料批次中不能检出的病毒。因此绝对需要一套完整的体外技术及方法用于人疫苗和生物药物的生产。新的方法的应用及测试灵敏度的不断提升,不仅能满足法规认证的需要,也能确保药剂的安全和有效。(生物谷Bioon.com)

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