Advanced Science：王宇团队等构建基于CRISPR-Cas的RNA适配体筛选系统

核酸适配体（aptamer）由诺奖获得者Jack Szostak命名，这是是一类短的、单链DNA（ssDNA）或RNA寡核苷酸，通过形成三维空间结构，结合特定蛋白或者细胞发挥作用。基于其独特的生物学和化学特性，核酸适配体正在用于诊断试剂和治疗药物的开发。指数富集的配体系统进化技术（SELEX）是核酸适配体筛选的金标准方法，主要基于核酸文库与目标蛋白或细胞在溶液中或者在细胞表面的亲和力作用，再结合深度测序捕获富集序列。与此同时，对CRISPR/Cas的改造，已经拓展出远远超过其天然核酸酶的功能，发展出了转录调控、表观遗传调控、基因组标记等丰富多彩的应用。

近日，深圳大学生命与海洋科学学院王宇课题组，联合广州实验室赵金存教授，清华大学谭旭研究员，中国科学院动物研究所周兵研究员以及深圳疾控中心张仁利教授，在 Advanced Science 期刊发表了题为：Repurposing CRISPR/Cas to Discover SARS-CoV-2 Detecting and Neutralizing Aptamers 的研究论文。

该研究报道了一种新颖的基于CRISPR/Cas的RNA配体筛选系统——CRISmers（CRISPR based aptamers screening system）。有别于传统的SELEX筛选，CRISmers将RNA适配体筛选从溶液体系或者细胞表面搬到了细胞内，从而提供了胞内天然生物环境下的RNA和蛋白质的折叠与相互作用，并避免了筛选过程中的环境波动影响。CRISmers通过CRISPR/Cas的转录激活功能，将RNA适配体与靶蛋白的亲和作用转化为抗生素筛选压力下细胞的存活能力，以每个单细胞作为相互隔离的物理单元，区分功能性事件和背景噪音。

CRISmers理论上具有广泛的靶向性，但考虑到研究进行期间正值新冠疫情，该团队将第一个靶标指向了SARS-CoV-2刺突蛋白受体结构域RBD。通过初级筛选和二级验证，获得了可特异靶向RBD的2个优选的RNA适配体，且在体外呈现出有效的病毒检测和中和活性。有趣的是，和其他论文中报道的一致，核酸配体表现出不受病毒突变影响的现象，具有广谱抗SARS-CoV-2的潜力。这一现象也许和核酸配体内在的柔性结构特性有关。类似的，不同的CRISPR/Cas系统的向导RNA也观察到可以互换的现象[7]。进一步，选取其中一条RNA适配体，团队发现，结合多种修饰和偶联，包括2’-氟嘧啶和2’-甲氧基RNA修饰（提升RNA稳定性），以及5’端胆固醇（呈递到呼吸道上皮细胞表面）和分子量为40kDa的聚乙二醇（延长体内半衰期）的偶联，经滴鼻给药，在小鼠体内实现了对Omicron BA.2活病毒的预防型和治疗型抗病毒中和活性。通过对比实验，团队发现胆固醇和聚乙二醇的偶联对于动物体内的活性不可或缺，尽管它们对于细胞水平上的中和活性可有可无。

最后，该团队还对CRISmers系统的通用适配性进行了验证。应用靶向SARS-CoV-2 RBD筛选获得的两个RNA配体，对CRISmers系统中的元件分别进行了替换，包括：

1）将dSpCas9替换成更小体积版本的dCasMINI-V4；

2）将抗性基因替换成荧光蛋白；

3）将筛选宿主细胞由人HEK293T细胞系替换成大肠杆菌，均可捕获到RNA配体与RBD的亲和力信号。