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Nature Methods:TALEN在斑马鱼同源重组中的精确基因组修改中的应用

来源:生物通 2013-03-04 13:16

Nature Methods杂志是Nature出版社旗下的著名期刊之一,也是方法学领域的权威刊物,主要刊载具有创新性的技术进展,在去年之前,大陆学者在此刊物上发表的技术文章仅有3篇。近期来自北京大学生科院,加州大学洛杉矶分校的研究人员在这一著名期刊上发表了题为“TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish”的文章,获得了备受关注的技术:TALEN的新进展,这也是近年来北京大学的首篇Nature Methods文章。

文章的通讯作者是北京大学生科院张博(Bo Zhang)教授,以及加州大学洛杉矶分校的林硕(Shuo Lin)教授,其中张博教授获得过不少斑马鱼研究方面的重要成果,曾成功突变了7个斑马鱼内源基因,其中大部分基因的突变效率大于30%,有3个基因的突变效率更是接近100%,并且近年以通讯作者也在Nat. Biotechnol,PNAS等高水平杂志发表论文多篇,获国家自然科学奖二等奖与中国高校科学技术奖一等奖。

斑马鱼(Danio rerio)是进行发育生物学研究的理想模式脊椎动物。不少重要的科学发现就来自于这种小动物,张博教授研究组主要以其功能基因组研究手段为切入点,进行基因功能以及表达调控机制的研究。此次这项研究则主要聚焦于目前一种备受关注的技术在斑马鱼同源重组中的精确基因组修改。

这种技术就是TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) ,这是一种人工改造的限制性内切酶,是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合,因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造,是一种非常有效的基因组改造工具酶。

由于TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合,形成二聚体发挥内切酶活性,导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB,Double-Strand Breaks),从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ, Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确,极易发生错误(缺失/插入),从而造成移码突变,因此可以达到基因敲除的目的。

2012年Science十大科学突破中提到了这种技术,指出这种方法相比ZFNs和 morpholinos具有几个优势:它们更便宜、更有效,尤其是以一种开发活性形式应用时。ZFNs只能靶向特异序列,而TALENs有潜力对任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效应是短暂的,而TALENs可造成永久性的改变。

以斑马鱼为研究对象,在最新这项研究中,研究人员提出TALENs在斑马鱼同源重组的靶向基因敲除能实现精密基因组改造。他们将TALEN的mRNAs,以及一种带有长同源臂(靶向酪氨酸羟化酶)的供体载体共同注射到斑马鱼卵细胞中,结果发现这种有效的基因修改能通过生殖系传递。此外研究人员还通过靶向另外两种基因,证实了这一点。

这不仅提出了一种基因工程的新方法,而且带有dsDNA供体的斑马鱼同源重组,也拓展了这种模式动物的应用前景。(生物谷Bioon.com)

TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish

Yao Zu,Xiangjun Tong,Zhanxiang Wang,Da Liu,Ruochuan Pan, Zhe Li,Yingying Hu,Zhou Luo,Peng Huang,Qian Wu,Zuoyan Zhu, Bo Zhang & Shuo Lin

We report gene targeting via homologous recombination in zebrafish. We co-injected fertilized eggs with transcription activator–like effector nuclease mRNAs and a donor vector with long homologous arms targeting the tyrosine hydroxylase (th) locus, and we observed effective gene modification that was transmitted through the germ line. We also successfully targeted two additional genes. Homologous recombination in zebrafish with a dsDNA donor expands the utility of this model organism.

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