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生物谷专访赛业(Cyagen)基因敲除鼠专家欧阳应斌博士

来源:生物谷 2012-04-16 15:06

【生物谷-BIOONNEWS编者按】转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业,催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN和TALEN等新技术的出现,或有可能将这一局面彻底改变。为此,我们采访了基因工程模式动物领域国际权威专家、赛业生物科技转基因动物中心主管、高级科学家欧阳应斌博士(前美国Taconic公司分子生物学部主管、高级科学家),从行业的角度出发,对转基因和基因敲入/敲除技术的发展进行一番综述。

生物谷BIOONNEWS:欧阳博士,您作为转基因模式动物(transgenic animal model)的一流专家,在美国业内占领导地位的公司主管技术研发多年,您能否介绍一下您的工作,以及您的工作所带来的科学价值?

欧阳应斌:十年前人和小鼠的基因组全序列测序完成后,人们发现,虽然人和小鼠体型差异巨大,但其基因组序列却惊人的相似。人的绝大多数基因我们在小鼠的基因组中都能找到其相对应的基因。加上小鼠及大鼠与人生理生化及发育过程非常相似,小鼠和大鼠已经成为研究人类生理病理机制的重要工具。我于2004年至2011年在美国Taconic生物科技公司任分子生物部负责人,今年加入赛业生物(Cyagen Biosciences),负责基因修饰小鼠及大鼠动物模型的研发。在七年多的时间里,我们为遍布全球的大学实验室,科研机构,生物技术公司及制药公司研制了近千种基因修饰小鼠及大鼠动物模型。这些动物模型的广泛应用极大的推动了生物医学的基础研究及新药的研发。现在利用基因修饰小鼠及大鼠动物模型作为研究工具所发表的生物医药科研论文数量每年都大幅增加,说明它们在生物医药科研中不可或缺的重要性。

生物谷BIOONNEWS:从1974年Rudolf Jaenisch博士把外源DNA引入小鼠早期胚胎并产生转基因小鼠至今已经近四十年了,您能否介绍一下基因修饰小鼠(GM Mice: genetically modified mice)在这近四十年间有哪些技术上的里程碑?

欧阳应斌:1974年,Jaenisch用显微注射(microinjection)将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚(blastocyst)中,在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA,证明了将外源基因导入胚胎细胞中的可能性。这算是第一个里程碑吧。之后我能想到的能够算作里程碑的有:

1980年,Gordon和Ruddle采用受精卵原核显微注射(pronuclear microinjection),首次成功地将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组,当时他们发明了"transgenic"一词,并称这种小鼠为"TG Mice: transgenic mice";

1981年,Evans和Kaufman首先从囊胚的内细胞团(inner mass)分离培养出多潜能的胚胎干细胞(ES cells: embryonic stem cells),并摸索出维持其全能性的体外培养条件;由于这一工作,Evans于2007年被授予了诺贝尔医学奖;

1982年,Brinster和Palmiter将携带有大鼠(rat)的生长激素基因和其调控区域的DNA片段注射到小鼠胚胎,得到了所谓的"超级小鼠"(supermouse),这是外源基因首次在动物体内得到表达;

1984年,Bradly等用ES显微注射(ES microinjection)将ES细胞注入小鼠囊胚腔,并移植回假孕母鼠,获得生殖系嵌合体(chimera),经过适当的交配,获得了源于ES细胞系的小鼠;

1987年,Capecchi和Smithies根据同源重组(homologous recombination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targeted integration),这一技术称为"基因打靶"(gene targeting)或"基因敲除"(gene knockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KO Mice: knockout mice);由于这一工作,Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖;

1998年,在著名的克隆羊多利(Dolly)诞生后仅一年,夏威夷大学的科学家第一次成功地克隆了小鼠;

2008年,芝加哥大学教授、休斯学院(HHMI)研究员、赛业生物(Cyagen Biosciences)首席科学家蓝田教授的研究小组成功建立了木鼠(wood mouse: apodemus sylvaticus)的ES细胞系,并通过显微注射将ES细胞注入小鼠囊胚腔,从而获得了木鼠和小鼠这两个遗传差异很大(进化距离1千万年以上,DNA差异18%)的物种的嵌合体,首次证明了哺乳类异种嵌合体(inter-species chimera)全程发育的可能;

最近两项新的基因打靶技术不仅把制作基因修饰小鼠的效率大大提高了,还使基因修饰大鼠(genetically modified rat)成为可能:2009年,美国威斯康辛医学院和Sigma-Aldrich公司等单位利用锌指核酸酶(ZFN: zinc finger nuclease)基因打靶技术成功构建了世界首例基因敲除大鼠(knockout rats);

2011年,法国南特大学首次利用TALEN(transcription activator-like (TAL) effector nuclease)基因打靶技术成功构建了基因敲除大鼠。

生物谷BIOONNEWS:您最后提到的ZFN和TALEN技术是什么原理?它们较传统技术有什么优势?能取代传统技术吗?

欧阳应斌:向基因组中引入外来的基因有很多种方法,不过它们各自都有很多局限,科学家们一直在寻找一种方法,可以对任意位点的基因进行精确的编辑,就像在Word里面编辑文章一样,看上去像天方夜谭,但使用锌指核酸酶技术(ZFN)基本上能做到,目前Sigma-Aldrich已有成熟产品。

ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点,并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA修复过程来实现DNA的插入、删除和修改,这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的,传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组,其效率只有百万分之一,而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入,可以把时间从一年缩短到几个月。

这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节,目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN,但ZFN的脱靶(off target),也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因,利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。

TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现,来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块,可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白,从而达到靶向操作内源性基因的目的,它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列,以及识别序列经常受上下游序列影响等问题,而具有ZFN相等或更好的灵活性,使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题,利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。

生物谷BIOONNEWS:最近基因修饰大鼠作为工具鼠也变得越来越受欢迎,这是什么原因?

欧阳应斌:同小鼠一样,大鼠的2.5万到3万条基因有90%以上都和人类基因同源,而大鼠在许多生理特性上要比小鼠更为接近人类,其较大身材使其成为易于手术操作和可连续采样的疾病模型和药物评估模型。建立基因修饰大鼠一直以来是一项重大挑战,因为大鼠的胚胎学(embryology)特性比较小鼠难以操作,大鼠ES刚刚建系,培养体系复杂,成本高昂,因此利用传统的方法制作基因修饰大鼠一直没有形成规模。但ZFN和TALEN这样的新技术的出现大大提高了基因打靶的效率,使基因的定点敲除和敲入在大鼠上的实现难度大大下降,从而催生了商业服务。我的预测是未来几年基因修饰大鼠将大大普及,这方面的研究也会激增。

生物谷BIOONNEWS:近几年国内对于转基因/基因敲除鼠的需求增长迅猛,很多实验室也在建设这方面的能力,您对于准备利用这一手段做研究的科学家们有什么建议?

欧阳应斌:是的,国内转基因/基因敲除鼠的需求增长非常明显,因为越来越多的科学家意识到高质量的研究只局限于体外(in vitro)实验是不够的,高端杂志的编辑也往往不满足于体外实验的结果,而体内(in vivo)实验小鼠是首选。大概十几年前很多美国大学和研究机构的生物实验室建了一大批自己内部的(in-house)显微注射实验平台,后来这阵风很快就过去了,因为大家发现这些in-house的平台是很划不来的,要熟练掌握这里面的技术细节不是一件容易的事,往往一两年以后等一个研究生刚刚掌握了这些技术,这个人也就该毕业了,这样持续性很差,很快这些昂贵的设备就没人会用了,落了一层土。再者,小鼠基因修饰的技术相对成熟,其本身并不能创造太多的科学价值,所以美国的科学家大多转向使用更有保障的商业服务。

现在中国这方面的情况大概相当于十几年前的美国,很多实验室都在建自己的平台,我的预测是这些平台很多将来都会废置,因为随着国内商业平台的兴起,in-house的平台会越发显得低效、高价和不实用。所以我的建议是如果你有这方面的需求,去找一家好的商业平台。我相信我们赛业是最好的,但做判断的应该是客户。

生物谷BIOONNEWS:您最近加盟赛业生物(Cyagen Biosciences),我们知道赛业生物在转基因/基因敲除小鼠方面做了大量工作,您能否介绍一下这些工作,现在作为赛业生物这方面的领头人,您的下一个目标是什么?

欧阳应斌:我很高兴于今年年初加盟赛业生物。这是一家充满活力、不断进取、发展迅猛的公司。过去几年赛业生物为国内外科学家提供了大量有价值的工作,赛业生物的名字也越来越多地出现在顶级杂志上。比如我们为斯坦福大学一个实验室建立了数十个转基因小鼠,帮助他们完成了特定基因的调控机制在人类进化中作用的研究,文章发表在Nature上,客户对我们十分满意。预计今年我们的名字还会像雨后春笋一样出现在各个顶级杂志上。

我加盟赛业以后,会重点建立前沿技术的服务能力。目前赛业已经有能力利用ZFN和TALEN技术进行小鼠和大鼠的基因敲除和敲入,我们正在优化流程,提高效率。我们的目标十分明确,就是在未来几年成为全球处领导地位的基因修饰鼠服务商。赛业在细胞生物、分子生物、蛋白、生物信息等方面的优势也会对我们实现这一目标起到很好的辅助作用。我们的口号是:"We help you discover life!"。我们希望有机会服务大家。

后记:由于时间问题,我们本期对欧阳博士的采访不得不告一段落,更多的关于转基因/基因敲除动物技术的讨论,我们将在后续对欧阳博士的采访中陆续报道。(生物谷 Bioon.com)

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