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基因组编辑工具新星---转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)

来源:生物谷 2011-12-18 13:43


TALE第171位Ser删除后的三维构象模型也显现出非常类似的球状结构,图片篇来自Biochemical Journal, 2004, 382: 725-731.

2011年6月,位于美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的生命科技公司(Life Technologies)获得美国伊利诺斯州埃文斯顿市双刀片基金会(Two Blades Foundation)和德国哈雷市马丁-路德大学一组植物学家的独占性许可以便对一种新的基因组编辑技术---转录激活子样效应因子(transcription activator like effector, TALE)进行商业化生产。随着生命科技公司新获得的许可,研究人员可能很快能够从几个设计物TALE商业来源中进行选择。而2011年1月,美国明尼苏达大学和爱荷华州立大学开发的类似技术已被许可给法国公司Cellectis,而且该公司已经提供定制的基因特异性的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)。与此同时,几个研究小组就像学术界之前对ZFN那样正在建立大众都可获取的TALEN来源。

当然,现在预测利用只在2007年发现的TALE进行基因组编译的最终影响仍嫌过早。相反,ZFN技术开发了将近15年,并且已经正在人临床试验中进行测试。但是这两种技术的差别是显而易见的。不同于ZFN---该技术的知识产权是由Sangamo生物技术公司和它的商业伙伴Sigma-Aldrich所有,TALE的使用、成本和可获得性则是完全不同的情形。

TALEs首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的,特异性地结合到DNA,在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。

每个TALE含有一个位于中央的重复区域,该区域由通常为33-35氨基酸的数量可变的重复单元组成。这是这种重复序列结构域(repeat domain)负责识别特异性的DNA序列。每个重复序列基本上都是一样的,除了两个可变的氨基酸,即重复序列可变的双氨基酸残基(repeat-variable diresidues, RVD)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。

一个TALE上用于序列特异性识别的DNA结合结构域融合到一个在DNA序列产生双链断裂(double strand break, DSB)的内切核酸酶的催化性结构域,便产生了TALEN。TALEN的DNA结合结构域能够在一个较大的识别位点进行高精确的定向结合。

TALEN被定义为异源二聚体分子(两单位的TALE DNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域),能够切割两个相隔较近的序列,从而使得特异性增强。它在用于基因组订制化(genome customization)方面表现出较高的效率和潜力。
 
尽管与锌指蛋白存在一些类似性:都是在自然中发现的、模块化的而且还具有自然的DNA结合特异性---,但是也存在较大的差别。锌指模块识别三联体碱基,而TALE结构域识别单个碱基。这就意味着人们只需要结合较少的锌指模块实现比较可观的特异性。比如,含有3个锌指模块的蛋白识别9到10个碱基对片段,但是它将需要9个重复的TALE来识别。但是三个锌指模块串联也意味着在识别序列如何识别上存在更少的灵活性,而且尽管有上百个锌指模块存在,但是仍然不能代表每个可能的序列。因此,研究人员不得不开发出方法来鉴定锌指模块可靶向的目的基因内部的序列,然而至少在理论上和大多数实践中,人们应当可以获得使用TALE时所需的任何序列。即便是最为忠诚的锌指狂热爱好者也会说,锌指模块不能靶向所有的序列。另一方面,TALE工作者正取得显著的成功。简而言之,对锌指模块而言,人们不得不让DNA指出需在何处靶向,但对TALE而言,是研究人员,而不是DNA,决定靶向何处。

另一个不同之处在于锌指模块需要大量优化才实现特异性基因打靶,然而TALE似乎即设计即使用就可以非常好地发挥作用。比如,对于多个锌指模块串联而言,锌指模块之间的相互作用能够降低它们的特异性,然而迄今为止,这种背景依赖性在TALE中尚未报道过。锌指结构域另一个的缺点在于当和FokI核酸酶融合从而形成基因编辑工具ZFN时,偶尔会发生脱靶切割和产生毒性。脱靶切割部分是由于锌指结构域的非特异性结合,部分是由于FokI核酸酶导致的。因为FokI必需形成二聚体才能具有活性,需要两个结合相邻位点的锌指结构域切割双链DNA。当两个锌指结构域在细胞中表达时,同源二聚体和异源二聚体通过FokI结合域的结合而形成,但是只有异源二聚体具有所需的特异性。因而,同源二聚体的存在提高不想要的结合的背景水平。几个研究小组已经设计出改造过的FokI二聚体界面以便尽量产生异源二聚体,可以降低但是不能完全消除脱靶切割。

奇特的是,当TALE即便是与野生型FokI融合产生TALEN,毒性可能很少是一个问题。TALE的脱靶效应尚没有进行仔细分析,但是当使用不是异源二聚体的锌指结构域时,人们能够观察到明显的毒性。对TALE而言,大多数研究都是用它的野生型界面。TALE技术的发明人之一Adam Bogdanove猜测一旦结合到DNA上时,ZFN单聚体可能要比TALEN单聚体有较大的联合倾向,或者锌指串联组成的锌指结构域可能对DNA有较大的非特异性亲和性,从而导致脱靶。

Sangamo生物技术公司也表现出对TALE的兴趣,它也是第一家发表利用TALE转录因子对内源性哺乳动物基因进行调节和利用TALEN对人内源性基因进行修饰的公司。但是Sangamo生物技术公司首席安全官Philip Gregory指出,锌指技术仍然是开发治疗药物的流行技术,而且也是他的公司的主要关注点,但是就TALE而言,讨论它的益处仍然尚早。

Gregory指出十多年的开发让人们对锌指技术有较深的认识,但是TALE则不是这种情况。确实,他声称人们对TALE的兴趣可以直接归结于锌指技术的成功。他预测TALE技术开发也将遵循锌指技术一样的发展路径。他警告道,“如果人们看一下10年前关于锌指技术的文献,很像当今的TALE一样,人们声称它有可塑性的潜力。但是可塑性并不完全是100%保证的。人们将证实TALE完全与锌指技术一样,潜力是好的,但是不是绝对的。”

部分是由于TALE技术处于早期阶段,部分是由于一些人对一种技术或另一种技术既定的兴趣,研究人员对每种技术的相对好处的评估存在差别。那些对锌指技术有很深了解的人们,如Sangamo生物技术公司工作人员,对TALE天花乱坠的宣传无动于衷。Gregory指出锌指技术当下正流行,而且表现出令人难以置信的强健性。另一方面,使用过这两种技术的学术研究人员则不这么认为。TALE技术发明人之一的Dan Voytas谈及锌指技术时说,“喜欢这种技术则会讨厌我们开发TALE技术的方式,我是指很多研究小组进行好几年的研究而开发出公众可以获得的ZFN设计平台。”另一方面,谈及TALE时,他说,“任何有分子生物学技能背景的人都能够在一周之内制造出几种TALE”。

Sangamo生物技术公司的合作伙伴Sigma-Aldrich公司自从2008年以来就提供定制的ZFN服务,并且为每个定制的ZFN标价25000美元而辩护道,“该技术需要全职员工花费6到10周的时间。我们不得不利用生物信息学从头开始设计,然后查阅锌指模块文档,将它们放在一起,并对它们进行测序以便确认是把所想的东西放在一起,再然后我们大量构建以便获得一个针对某个特定基因的极其高效的切割分子。”

Gregory声称一个熟练的研究人员组装ZFN与组装TAlEN很少有差异。他说,“在相同的时间范围内,我们能都产生研究级的复合物”。

但是由于对TALE的研究时间比较短,未知因素也比较多。在它们当中最为关键的就是由于缺乏太多基础性研究,TALE不能像计划中那样开展。尤其对TALE而言,如果使用一个简单的组装TALEN实验步骤,如果取得成功结果,那还不错,但是如果失败了,人们也不清楚下一步将做什么。而锌指技术的问题则是一旦人们获得ZFNs,它们就是非常特异性的,但是只当人们用它们去开展研究时才发挥作用。

另一个未知因素是TALE在全基因组DNA上的特异性。这个问题还没有得到仔细研究,而且TALE对人细胞的毒性还没有人报道过。

还有一个未知因素就是免疫原性。因为锌指在自然界中是广泛分布的,这可能不是个问题。事实上,Gregory说,“锌指免疫原性非常低。我们不能在任何物种中用锌指制造出抗体,而且也没在参加临床试验的人们或临床前动物研究中观察到存在免疫原性的任何证据”。另一方面,TALE是在植物病原菌中发现的可能在治疗时会存在问题。但是正如加州大学戴维斯分校的Dave Segal指出的那样,“大多数应用,比如CCR5基因(趋化因子CC-基序受体5,也是一种利用ZFN技术在体外CD4+细胞中基因敲除的HIV辅助受体)从没有看到对免疫系统的使用”。

TALE领域大多数参与者对他们把这项技术申请专利的计划都有足够的理由保持沉默,不过迄今为止已经公开的少量专利申请文件和随后的许可行为就已暗示着这方面情况的可能走向。

2009年,破解TALE密码的两个小组中的德国小组是第一个提交专利申请的。这项保护范围写得宽泛的专利涵盖TALE设计和使用的方方面面,包括融合蛋白,而生命科技公司也正是获得这项技术的许可以便开展所有方面的商业应用,但要排除植物方面的商业应用,因为这方面受到双刀片基金会的技术限制。而美国明尼苏达大学/爱荷华州立大学小组是第一个把他们的技术许可给Cellectis公司的小组,在2010年提交专利申请,相关文件最近已经发布。他们的专利关注点在TALEN,它的发明人Adam Bogdanove说,“尽管我们不清楚我们的德国伙伴专利确切包含哪些东西,但是他们已告诉我们他们已经提交关于TALE密码的专利申请。我们把我们在知识产权上的努力集中在DNA上进行位点特异性切割的TALEN上,在我们发现这一密码后不久,我们开始启动了这一发明”。

德国发明人小组成员Jens Boch觉得该技术的核心就是TALE密码,他说,“那就是它的核心,因为你不得不设计一个DNA结合结构域。我们两个小组在破解TALE密码上存在一个关键性差别,该差别在于他们(即Bogdanove小组)是通过生物信息学得出结论的,而我们则是开展大量实验来证明实际确实如此。从这点来看,我们的论文更多的是原理证明,不过观点基本上是一样。”

所有这些就产生问题:研究人员能够获得什么,专利申请和许可是否和如何产生影响。双刀片基金会董事和首席运营官Diana Horvath觉得传播这项技术的最好方式就是通过许可。他说,“鉴于它的自由获得性缺乏,我们在思考通过研究工具供应商来提高它的使用,从而降低成本,并像限制性酶那样列入产品目录中”。这种想法得到Cellectis公司销售和营销副总裁 Luc Selig的响应,他说,“我们想把我们的产品传播出去。我们的目标是这些迄今为止在几十个实验室中使用的工具应当能被每个人所使用,毕竟它们的潜力是巨大的”。作为一家小型的法国生物技术公司,而且也面临着大型的生命科技公司的竞争,Selig说,“这就意味着有市场。对于新的市场,对于新的技术创新,如果在市场上只有一家公司,那么就应当想想是否真地存在市场”。

Cellectis已将他们设计的TALEN标价为5000美元,这对于预算有限的学术研究人员而言明显具有吸引性。Bogdanove指出,“按照他们的标价,设计的TALEN不应当是预算中的关键部分,而只是其中的一部分”。Selig在解释他们标价的理由时说,“ZFN的价格对于很多实验室而言,价格过高。要为每个人提供基因组编辑定制化工具,价格是关键,因此相对于Sigma-Aldrich公司提供的ZFN定制价格,我们实际上打了八折”。

来自生命科技公司的竞争可能会进一步把TALE的价格拉低,但是这样的情形在ZFN中从未发生过。2007年,Sangamo生物技术公司把ZFN技术独占性许可给Sigma-Aldrich公司。尽管Sigma-Aldrich公司如今提供在特异性位点敲除人特定基因的“现货”ZFNs---目前尚未被研究人员选购---标价为12000美元,为定制ZFNs的一半,但是它们对很多学术研究实验室而言仍然可能因为价格高而无法使用。

毫无疑问,TALE给予基因组工程师一种新的强大工具,并且兴奋之情,尤其是在学术研究人员中间,是显而易见的。那些对锌指技术特别热情的人们则对此并不乐观。Gregory指出ZFN技术已经有15年的开发时间。

但是必须指出的是,Sangamo生物技术公司也在TALE技术投入大量努力,这从最近的学术发表物中就可看出。这意味着TALE也是值得研究的事情。Segal也同意道,“Sangamo生物技术公司工作人员把TALE视作另一种好东西。”

明显的是,尽管关于TALE的设计和使用仍有很多需要了解,但是已有一些人正在预测一条比ZFN更为平坦的道路。双刀片基金会Diana Horvath说,“对这些蛋白还没开展15年研究和需要开展15年研究以便开发出有用的产品存在细微的差别”。无论TALE是否将替换ZFN或者只是作为ZFN的补充,仍然有待进一步观察。Gregory仍然很坚定地说,“我的观点是ZFN为开展的任何类型的基因组编辑技术设置一个非常高的标准”。(生物谷:towersimper编译和整理)

参考文献:
Laura DeFrancesco. Move over ZFNs. Nature Biotechnology.2011 August, 29:681-684.

Move over ZFNs

Laura DeFrancesco

A new technology for genome editing may put the zinc finger nuclease franchise out of business, some believe. Not so fast, say the finger people. Laura DeFrancesco reports.

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