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基因组编辑工具锌指核酸酶(ZFN)研究进展——2011生物谷研究盘点

来源:生物谷 2011-12-19 10:17

锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN),又名锌指蛋白核酸酶,不是自然存在的,而是一种人工改造的核酸内切酶(图1),由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成,其中DNA识别域赋予特异性,在DNA特定位点结合,而非特异性核酸内切酶赋剪切功能,两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。


图1. 结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色),图片来自维基共享资源,Thomas Splettstoesser

DNA识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白串联组成,研究还表明每个锌指蛋白识别并结合3′到5′方向DNA链上一个特异的三联体碱基以及5′到3′方向的一个碱基。

锌指蛋白源自转录调控因子家族(图2),在真核生物中从酵母到人类广泛存在,其共有序列为(F/Y)-X-C-X2−5-C-X3-(F/Y)-X5-ψ-X2-H-X3−5-H,其中X为任意氨基酸,ψ是疏水性残基。它能形成α-β-β二级结构,每个锌指蛋白含有单个锌离子,这个锌离子位于双链反平行的β折叠和α螺旋之间,并且与β折叠一端中的两个半胱氨酸残基和α螺旋螺旋羧基端部分的两个组氨酸残基形成四配位化合物,此外α螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性,骨架结构保守。


图2. Cys2-His2锌指单元首先是在TFIIIA中鉴定出的。TFIIIA含有9个大约30个氨基酸基序的串联重复。

现已公布的从自然界筛选的和人工突变的具有高特异性的锌指蛋白可以识别所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列,具有很强的特异性和可塑性,很适合用于设计ZFNs。

与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI羧基端96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶,只在二聚体状态时才有酶切活性,每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,当两个识别位点相距恰当的距离时(6~8 bp),两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。

一、ZFN工作原理
针对靶序列设计8~10个锌指结构域,将这些锌结构域连在DNA核酸酶上,便可实现靶序列的双链断裂(Double strand break, DSB)。Kim等使用该策略设计出了第一个锌指蛋白核酸酶,该酶使用3个锌指结构域连接一个FokI核酸酶的催化活性功能域。结果表明人工合成的 ZFN 可以特异性的识别切割靶位点。ZFN 要切割靶位点必须以二聚体绑到靶位点上。因此两个ZFN分别用锌指结构识别5′到3′方向和3′到5′方向的DNA链,两个FokI核酸酶的催化活性功能域可以切割靶位点。

当两个ZFN分别结合到位于DNA的两条链上间隔5至7个碱基的靶序列后,可形成二聚体,进而激活FokI核酸内切酶的剪切结构域,使DNA在特定位点产生双链断裂(图3),再通过非同源末端连接或同源重组修复断裂(图4)。


图3. ZFN作用示意图,不同的FokI核酸内切酶结构域与识别特定序列的锌指模块结合形成ZFN。右侧ZFN与左侧ZFN分别结合9-18bp长度的靶序列,并形成二聚体,FokI核酸内切酶的剪切结构域对两端靶序列中间的DNA序列进行剪切。

当两个ZFN切割靶位点,制造出双链断裂以后,细胞的修复机制被激活,DNA的同源重组机制会将同源片段复制到断裂缺口上,从而达到引入基因片段的目的。ZFN制造出双链断裂,DNA同源重组修复引入外源片段的效率增加了几千倍(图4)。此外也有通过非同源末端连接(Non-homologous end-joining, NHEJ)引入外源基因片段的报道,该方法所需的外源基因片段可以缩短到50bp左右。


图4. ZFN介导的靶向基因修饰的细胞DNA损伤修复途径

如果DNA修复是非同源的末端连接,将会有大约70%的概率通过随机删减或添加可以引起移码突变的碱基,或无义突变引起蛋白质长度变化,从而导致基因敲除,如果修复过程中引入模板发生同源重组可以对目标基因进行修饰。

非同源重组末端连接机制在体细胞的 DNA 损伤修复中起主导作用,而同源重组机制倾向于在 ES细胞中正调节。在早期胚胎中,由核酸内切酶引起的双链断裂会选择两种机制的哪一种,以及这两种机制如何被调节,也会是未来 ZFN 研究中的重点。

二、ZFN设计
因为ZFN识别和结合特异性是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白串联组成的DNA识别域决定的,所以在设计ZFN时主要还是设计如何将多个Cys2-His2锌指蛋白串联,以及如何通过改变α螺旋的16氨基酸残基决定每个锌指蛋白识别和结合特定的三联体碱基。

Isalan等使用噬菌体展示技术鉴定了与靶DNA序列具有较高亲和力的锌指结构,该实验表明根据已知的DNA序列可以找到与之结合的锌指结构。由于一个锌指结构域只能识别3 bp (Base pair)。对于全基因组来说至少有18bp才能确保靶位点的特异性。因此需要有8~10个锌指结构连在一起才能实现长片段的识别。因为Doyon等用8个锌指结构域实现了DNA的特异识别,而且没有脱靶现象,因此可以认为 8~10 个锌指结构域就可以实现靶位点的特异识别。

但是随着DNA加长,9 bp并不对应3个锌指结构域,因此 Moore等的实验设计了两种策略来确定锌指结构域: (1) 3×2F,这种方法在靶序列中,每隔6个碱基跳过一个碱基,两对锌指结构域之间插入一个甘氨酸(GLY)。(2) 2×3F,这种方法在靶序列中,每隔9个碱基跳过两个碱基,两个三联体锌指结构域之间插入甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(Gly-Ser-Gly)。实验表明2×3F方法设计的锌指蛋白对靶位点的突变非常敏感,因此2×3F方法设计的锌指蛋白对靶序列的识别特异性更高。

人工合成的锌指结构域采用了通用的氨基酸序列作为模板,这个氨基酸序列框架被证明是高效的,如图4所示。锌指结构域中有7个氨基酸残基(XXXXXXX)用于识别三联体碱基,X位置为可变的氨基酸,改变这些氨基酸可以识别不同的三联体碱基,其上部表示氨基酸在α螺旋上的位置。因此可以通过改变这些氨基酸残基来提高锌指结构域识别靶DNA的特异性。TGEK序列用于连接相邻的两个锌指结构域。


图5 锌指结构通用氨基酸序列

目前的实验已经测定了一些识别三联体碱基的锌指结构域氨基酸序列(Maeder ML et al.; Wright DA et al.),这些氨基酸序列被证实与靶序列有较高的亲和力。在设计锌指蛋白的时候通常以这些氨基酸序列作为参考。

虽然是以设计ZFN的DNA结合域为主,但是也可对目前使用的ZFN的核酸酶结构域进行突变改造了,这样可以防止同源的ZFN结合在一起,造成非特异性切割。

最后,因为Sangamo公司是锌指核酸酶的专利持有者,所以该技术一直以来被Sangamo生物公司所垄断,该公司只与部分科研机构合作。现在这种形势得到了改变,一个由八个实验室组成的协会,波士顿麻省总医院分子生物学家J. Keith Joung召集八个实验室组成协会提出了一个开放性代码方法应用制备有效的锌指核酸酶。该组织创建了一个数据库,里面有66个“锌指”库,每一个锌指结构可与一个特异的DNA位点结合。这些特异的锌指结构与Fok I核酸酶结合,可特异地剪接一种植物细胞基因和3种人类细胞基因,剪接后达到预先改造基因的效率高达50%,而传统的基因疗法改造基因的效率只有1%。

该锌指技术协会将66种锌指结构蛋白储存在在低温冰箱里,每一个实验室都可以通过以200美元的价格预定一种锌指蛋白。该协会计划扩增锌指结构的储存量,制备192种锌指结构,而这么多种锌指结构通过组合就足以满足与人类基因组任一位点结合的目标。Joung说,这一计划为每一位学术研究者提供了便利,这样他们无需通过Sangamo公司就能直接获得锌指。虽然现在科学家们可通过申请获得锌指结构,但是设计与锌指结构结合的核酸酶不是件简单的事,一个分子生物学的研究生或是博士生要想设计完美的锌指核酸酶至少要花费1到2个月的时间。

锌指技术协会面向所有研究者提供免费的OPEN(Oligomerized Pool Engineering)设计,OPEN 设计及其资料是共享并可免费获取的(http://www.addgene.org/zfc; www.zincfingers.org/software-tools.htm)。

基于此,后来人们又提出ZFN 识别结构域的两种主要设计思路:其一是简单地将能够识别三个连续碱基的锌指作为一个“模块”,再根据目标序列把不同的 “模块”拼接在一起,这种方法被称为 “模块组装法”。这种设计思路中ZFN特异性的效率是由每一个模块的特异性效率所决定的,模块活性的筛选方法主要是利用细菌双杂交 (B2H) 技术:将目标序列克隆到报告基因的上游调控区,一个“模块”与诱饵蛋白组装成融合蛋白,靶蛋白与 RNA 聚合酶组装成融合蛋白,通过定量检测报告基因产物来比较模块识别结构域与目标序列的亲和性,再将多个高亲和性模块组装,再次测试亲和性。这种方法的缺点在于即使每一个模块的亲和性都很高,组装所产生的综合作用却不一定理想,可能的原因在于多个锌指蛋白之间的空间结构及作用力相互产生不可预期的影响。

另一种设计思路是上文所提到的OPEN,同样利用了细菌双杂交技术进行筛选,OPEN 作为一个共享的锌指资源库,每个锌指库中针对一个特异的三联碱基包含了大量的不同氨基酸序列的锌指识别结构域,通过将不同的库组合在一起可以得到成百上千种 ZFN的组合,其中亲和性高的组合将激活下游的药物筛选基因,并在选择培养基中获得竞争优势。

三、ZFN应用
在谈及ZFN应用之前,先以小鼠和大鼠基因敲除的发展历史来谈谈先后采用哪些技术来实现的以及它们各自的不足。

基因敲除模式动物非常适合用于研究基因功能。在哺乳动物中,特异性基因组序列打靶传统上只在小鼠身上开展。该技术需要通过同源重组在多功能胚胎干细胞上进行基因/外显子打靶。成功实现基因打靶的胚胎干细胞克隆细胞系注射进胚泡产生嵌合小鼠,再通过异型杂交获得更为强健的小鼠培育系以便实现重组工程转基因的生殖系传递(germline transmission)。这种方法耗时,只是用于极少数特定的小鼠近交系。但是通过同源重组在多功能胚胎干细胞中产生基因敲除大鼠还没获得成功,最大的障碍在于不能建立生殖系有活性的多功能胚胎干细胞。然而,在多个实验室的努力下,研究人员已经能够采取一种复杂的实验方法获得生殖系有活性的多功能胚胎干细胞并且同时维持这些胚胎干细胞的多能性。

随着大鼠越来越成为基因研究模式生物,人们也采用其他的生殖系打靶技术,如精原干细胞(spermatogonial stem cell)慢病毒转基因技术、体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer),但是都没有取得成功。但是其他的基因组操纵策略如RNA干涉介导的基因沉默和两种靶标选择性基因敲除技术,即N-乙基-N-亚硝基脲诱变(ENU mutagenesis)和转座子介导的基因捕获。N-乙基-N-亚硝基脲诱变产生随机性点突变,它的优势在于能够潜在性用于鉴定一个基因的多个等位基因,但是也只在基因编码区提前产生终止子才能确保等位基因被敲除。而转座子介导的基因捕获通常利用诸如睡美人转座系统(Sleeping Beauty transposon system)之类的转座子实现插入性突变,但是突变率比较低,它的优势在于只当转座子从捕获基因上跳出时产生的等位基因遭到破坏,从而实现基因敲除。

利用ZFN在基因组特定位点---如靶基因上一个外显子---产生DNA双链断裂。每个ZFN上的FokI结构域产生平端的双链断裂。但是由于FokI结构域切割不是非常精确,它将会在不同位点进行DNA切割,产生大同大小的缺失片段。细胞内双链断裂修复系统中错误倾向的非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)封闭这种缺口。如果针对的是靶基因外显子的话,这种过程经常导致无义突变,从而产生等位基因敲除。该技术的优势在于它能应用于多种多样的细胞类型,包括单细胞期胚胎,这就使得它在缺乏多功能干细胞的模式生物如果蝇和斑马鱼中也大有作为。

但是ZFN诱导的双链断裂并不一定会导致靶基因被适当替换,这可能是因为NHEJ更加频繁地发生。但是在NHEJ存在缺陷的遗传背景,如即缺乏NHEJ必需的基因DNA连接酶IV (lig4)的胚胎,完整的同源重组修复途径也介导靶基因替换的效率。但在哺乳动物模式系统中,这种技术的一个主要不足在于纯合子小鼠中lig4基因敲除在胚胎阶段是致命性的。小鼠中NHEJ途径的其他组分敲除也是类似胚胎致命性的,或者导致严重联合免疫缺陷相关综合症。但是在单细胞期胚胎阶段,如果NHEJ途径暂时受到抑制,增加的DNA损伤同时也不破坏发育过程,也可通过同源重组介导的双链断裂实现靶基因替换,比如短暂表达针对NHEJ途径某种组分的小干涉RNA(siRNA)可能足够长时间和强健地限制NHEJ途径发挥作用,以便同源重组介导的双链断裂修复整合进所需的基因构造片段。

虽然RNA干涉技术或培育合适的基因敲除小鼠来研究移除单个基因的影响来实现,但是RNA干涉并不总是起作用,而培育基因敲除的小鼠需要花费好几年的时间和大量的精力。病毒(如慢病毒和腺病毒)转基因技术又往往会在宿主基因组引入不想要的DNA序列。N-乙基-N-亚硝基脲诱变(ENU mutagenesis)和转座子介导的基因捕获技术要么导致随机性突变,要么是基因敲除效率过于低下。随着ZFN技术的出现,人们也越来越多地利用ZFN技术在序列的特定部位精确的切断、修改或添加基因来创造新型细胞或整个生物体,而不是引入外源DNA,只是稍微改变植物自身DNA的序列,是一种新型的转基因技术平台,与传统的生物技术费时、耗力和不可预测相比,该技术为动植物转基因提供了一种新的有效的途径,并可降低产品开发的成本和复杂性。

ZFN能够对靶基因进行定点断裂和基因敲除,显著提高同源重组效率,是一种高效的新型基因打靶技术, 迄今已在黑长尾猴、大鼠、线虫、小鼠、中国仓鼠、非洲爪蟾卵细胞、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、大豆等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中,  以及包括iPS 细胞在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变,  其中果蝇、斑马鱼、大鼠等物种还获得了可以稳定遗传的突变体,  这为在新的物种中实现基因打靶带来了希望。

ZFNs曾用于增强非洲爪蟾卵细胞、线虫、果蝇及斑马鱼细胞的同源重组(Bibikova et al., 2001; Morton et al., 2006; Meng et al, 2008; Doyon et al., 2008)。在果蝇中ZFNs介导的同源重组频率相当可观,有时大于1%的子代发生了同源重组介导的基因打靶事件(Beumer et al., 2006)。在斑马鱼中,30%-50%的个体将ZFN诱导的突变传给了子代,而7%~18%的子代为突变型。通过SOLEXA测序发现,在形态正常的胚胎中,脱靶现象仅出现1%。

在植物上,Lioyd 等(2005)在拟南芥中用ZFN诱导了染色体基因的定点突变,后代的突变率高达 20%。Voytas的研究小组证明ZFNs可以提高植物基因定点整合和置换频率,他们在实验中设计了一个缺失了600bp的靶基因GUS:NPTII,将含有该600 bp的同源DNA片段和ZFNs瞬时表达载体共同转化烟草原生质体,转化细胞的10%获得基因定点置换,比不用ZFNs时效率提高了104~105倍。分子检测表明20%的重组事件是精确的,没有伴随碱基的缺失或插入(Wright et al.,2005)。这一结果表明利用ZFNs定点切割染色体DNA,可以显著提高同源重组介导的基因定点整合效率,这为基因定点整合和置换提供了一个非常有潜力的工具。而2009年Meng等和Townsend等分别利用ZFN在玉米和烟草开展研究并且在《Nature》杂志上发表研究成果,其中陶氏益农与Sangamo公司的科学家利用ZFN将一种杂草耐性基因导入玉米基因组的预设位点,破坏玉米中的ZmIPK1,永久性地与杂草耐性基因相连,将两个需要的性状堆叠在一起,抑制肌醇六磷酸的合成,抗除剂基因通过正常繁殖遗传到下一代,获得了抗除草剂和减少肌醇六磷酸水平的双重好处;而明尼苏达大学和麻省总医院基因组工程研究中心的研究人员利用ZFN改变烟草植物细胞单个基因的序列,获得了抗除草剂特性的烟草。

在哺乳动物上,2009年Geurts等报道了利用ZFN技术获得的基因敲除大鼠,这是该技术首次成功地在哺乳动物胚胎中进行基因操作,研究人员设计了三种ZFN,分别以外源基因GFP、内源基因IgM和Rab38为靶点,将编码ZFN的DNA或mRNA通过原核注射或胞浆内注射的方法导入大鼠胚胎中,从而获得了敲除特定基因的转基因大鼠,而且这一基因操作的结果可稳定遗传。2010年Mashimo等将编码特定ZFN的mRNA原核注射至大鼠受精卵中,敲除了IL-2受体γ链基因,从而获得了X连锁重症联合免疫缺陷(X-SCID)大鼠,为评估药物治疗和基因治疗的效果提供了新的动物模型。ZFN技术在其他哺乳动物身上也得到了成功应用 2010年Carbery等采用ZFN技术成功地敲除了小鼠的Mdr1a、Jag1、Notch3三个基因。2011年Whyte等利用ZFN技术在带有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的转基因猪的成纤维细胞中敲除eGFP基因,得到了不能发出荧光的后代,成功建立了大动物基因敲除模型。

ZNF技术亦具有潜在的临床应用前景。传统的基因治疗的方式主要有两种,一种是利用病毒携带完整的基因序列送入人体内或者是注入一小段正确的DNA序列来修正错误或者使错误的基因不表现,然而到目前为止,事实上科学家都无法确认这些方法在实际应用上是有效率及安全的。而藉由同源互换的原理使得细胞自行修正错误的DNA序列是发展基因治疗上最基本的原则。这一过程通过两个独立的步骤完成:首先在DNA中引入一个双链断裂,启动细胞自身的修复系统;之后“同源重组”参考引入的相似序列作为模板修复这段基因,从而实现指定部位的碱基替换。

2005年Urnov等针对一个IL2R基因上的突变而引起X-SCID来设计了四个锌指结构域串联的ZFN。SCID会使T细胞失去对抗外界入侵及感染的能力,而科学家们结合注入正确的DNA片段及ZFN的方式在培养皿中处理这些SCID的T细胞。利用该系统介导了人类细胞IL2R酌的高效修复。在无选择压力下修复效率达15%~18%,而实际在体内,修正后的细胞比原来的突变细胞具有选择优势,故这样的修复效率已足够用于基因治疗。

2008年Perez等使用锌指蛋白技术为载体携带特异的酶阻断T细胞中的CCR5基因的表达可促进T细胞清除HIV病毒,研究结果表明,改造的T细胞可有效抵抗HIV。在此几年前Sangamo生物技术公司就开始设计用于与CCR5基因结合并阻断CCR5活性的酶,阻断CCR5活性可激活T细胞抵抗HIV的能力。通常HIV病毒紧紧吸附在CCR5表达的蛋白上,并感染T细胞,我们知道在自然条件下CCR5基因突变的人对HIV具有天然的抵抗力。Sangamo公司开始与位于宾夕法尼亚州费城的Abramson Family 癌症研究所Carl June带领的实验室开展合作,设计各种应用酶,从中筛选最适合用于阻断CCR5基因的酶。他们发现最佳的酶可阻断人类T细胞中40-60%的CCR5基因的表达活性。

2011年6月Li等通过使用ZFN替换体内的一种功能异常基因hF9,研究人员成功地使患有人血液疾病乙型血友病(hemophilia B)的小鼠恢复了差不多正常的血液凝结功能。这种成就代表着科学家们第一次已经能够利用ZFN进行的“基因组编辑(genome editing)”来永久地校正活的动物体内的细胞DNA,也为这种技术可能有朝一日用来治疗很多人类疾病提供希望。与称自己为“锌指公司”的里奇曼生物技术公司合作,Li等构建了患有人类遗传缺陷导致的乙型血友病的小鼠---这种疾病是一种遗传性出血性疾病,特征在于极其低水平((比正常水平的1%还要少)的凝血因子IX,而这种蛋白是凝血必不可少的。研究人员随后设计了一种ZFN来切割功能失常的hF9基因的前端,利用一种病毒载体携带这种酶到小鼠的制造凝血因子IX的肝脏中。他们将这种ZFN跟一种不同的载体携带的正常基因密码的模板一起注射进两天大的小鼠的腹部。当小鼠为9周大时,研究小组开始在治疗过的一组小鼠和对照组小鼠血浆中测试人凝血因子IX,结果治疗过的小鼠中凝血因子水平与正常水平的6-7%一样高---足够高使得它们的血液在近乎正常的时间内凝结。

2011年7月Frank Soldner等第一次在人类干细胞中修饰了单个引起疾病的突变,同时也不用改变干细胞基因组的任何其他部分。来自怀特海德生物医学研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)Rudolph Jaenisch实验室的科学家们利用锌指核酸酶在诱导性多功能干细胞α-突触核蛋白(alpha-synuclein)基因---已知该基因在帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)上发挥作用---小心谨慎地插入或移除单个碱基对。该方法具有对病人起源的人iPSCs(huamn iPSCs, hiPSCs)中引起疾病的点突变进行基因校正的强大能力,代表着基础生物医学研究的巨大进步和基于人iPSCs的细胞替代治疗方面的一次飞跃。

2011年8月Hoeher等已成功地证明基于ZFN的基因治疗技术可以让导致皮肤起疱的缺陷性蛋白失活。研究人员利用ZFN在体外成功地关闭人皮肤干细胞中导致皮肤起疱疾病的致病基因,为了更好地证明这种方法可行性,研究人员利用基因工程手段改造皮肤干细胞,使之携带绿色荧光蛋白基因,然后用同样的特异性ZFN进行处理,结果在每五个处理的细胞当中成功地关闭了其中一个细胞产生的绿色荧光,而且即便在用高剂量ZFN处理后,皮肤干细胞仍保持着它们再生皮肤的全部潜力。这就为利用ZFN开展基因治疗提供希望。

2011年10月Sangamo生物技术公司在Nature杂志上发表一项临床前研究论文证实可以利用ZFNs来进行高度特异性和功能性地校正从病人皮肤细胞获得的iPSCs中α1-抗胰蛋白酶(Alpha 1-Antitrypsin, A1AT)的基因缺陷。研究人员首先使用ZFNs在正确的地方将该基因的基因组剪断,并用 piggyBac转座子的将正确版本的基因插入其中,再将该转座子序列从细胞中剔除,并将人体诱导多能干细胞能转化为肝脏细胞,而在修正位点没有出现任何DNA被破坏的痕迹。随后,科学家们通过在试管和老鼠实验中观察正常α1-抗胰蛋白酶蛋白的活动,证明这种经过修正的基因在他们制造出的肝脏细胞中非常活跃。重要的是,对ZFN校正的iPSCs细胞系进行全编码序列分析表明ZFN活性带来的唯一修饰就是对存在缺陷的A1AT基因的修复,从而证明利用ZFNs技术可以实现非凡的特异性,同时还表明基于ZFN的基因组编辑技术的精准性和广泛适用性使得该技术可以用来治疗单基因疾病。

四、ZFN限制
ZNF技术用于临床治疗还有很长的路要走。例如,人们不能预期引入的ZNF蛋白是不是会引起免疫系统的进攻。并且至少到目前为止,这样的技术似乎只能用于那些可以从病人体内抽取出来的细胞,对他们进行体外操作,再注回病人体内:直接体内注入基因的效率还太低了。最后,ZNF操作在细胞内到底精确程度如何,也必须小心评估:极少的错误也可能导致产生细胞癌变等严重的后果。

再者,一种DNA靶向技术,若应用于实际的科研或医疗中,需要有高度的特异性,即要避免错误的酶切(off-target)。然而事实上,DNA剪切的准确性由于ZNF剪切的机制而并不像人们预期的那样强:DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化,和至少一个单元结合DNA。因为二聚化的过程是独立于DNA剪切的,异二聚体的形成,和两种单元所形成的同源二聚体,同样可以造成DNA的剪切,并且他们有着不同的识别序列。可以想象,具有较低特异性的同源二聚体形式的ZNF会切割基因组中的假回文序列。而且,在某些特定条件下,单一ZNF单元结合于DNA(识别序列只有9~12 bp)也会造成DNA的剪切。如此,两个不同的ZNF单元总共可能产生七种不同识别序列的内切酶。这些非特异性行为均可能带来ZNF毒性。

2007年Miller等人和Szczeoek等人分别改进了这一技术。他们构建了一系列偏爱异二聚体形成的FokI酶。通过审查FokI的晶体结构,两个小组均对介导酶的两个单元结合的两个alpha螺旋上的氨基酸做了突变,以减少同源二聚体的形成:研究人员构建了一对不对称的界面。虽然脱靶显现明显减少,但是仍然不可避免单个ZNF单元结合于DNA时发生的酶切,也许进一步的发展中,人们需要彻底破坏FokI部分结合DNA的能力。

虽然人们知道ZFN剪切时偶尔会发生脱靶,剪错位点,导致未曾预料到的裂口,但是直到现在还没有一种真正综合性的方法来定义ZFN的特异性,然而人们开始利用ZFNs治疗病人和修饰基因组时需要知道这些修饰是在哪些序列位点进行的。
2011年8月发表在Nature杂志子刊上的两篇论文描述了两种系统性地研究这种脱靶作用的方法,从而能够有朝一日有助于设计出避免间接伤害的基因治疗。

在第一篇发表在《自然-方法》Nature Methods杂志上论文中,为了系统性地描述这些脱靶切割位点,哈佛大学化学生物学者David Liu和他的同事们利用1000亿个DNA片段组成的文库---一些片段在人类基因组中出现---对两种ZFN进行测试。大多数情况下,这些核酸酶切割靶位点,但是它们偶尔也切割其他类似序列---包括一种与癌症信号传导途径相关联的基因。Liu说,“对我们论文的肤浅理解可能导致一个人对ZFNs持悲观态度,但是实际上我是乐观的”。他说,除了证实脱靶裂口所占份额会随着较低浓度的ZFNs下降外,研究人员们还发现使用与靶序列结合较差的ZFNs似乎产生更少的意料之外的裂口。这就表明有可能设计出使得这些脱靶效应最小化的ZFN治疗。

在第二篇发表在 《自然-生物技术》Nature Biotechnology杂志上的研究论文中,研究人员们给人白血病细胞施加一种切割CCR-5受体的ZFN。他们首先构建结合到DNA裂口末端的带有标记的病毒颗粒,然后利用这些病毒颗粒转染细胞,来鉴定ZFN切割位点,结果他们发现ZFN总体上结合到靶CCR-5 DNA序列。但是,它大约2万分之一的概率切割序列几乎相同的另一个受体基因,以及甚至更低概率地切割少数几个其他的类似序列。但是Sangamo BioSciences公司科技总监同时也是这篇研究论文的共同作者Phillip Gregory说,这些结果都是在研究人员们采用一种极度高浓度的ZFN和极易允许ZFN作用的细胞系的条件下进行的,目的是观察最糟糕的情形会是什么样子。他说,即便是在这些条件下,低概率的脱靶切割事件“证明我们的期望:ZFNs蛋白定会是高度特异性的”,而且暗示在临床中采用更低药用剂量将几乎不可能发生脱靶切割。

这些方法可能有朝一日用于早期药物开发以便筛选特异性最好的候选药物。但是人们不清楚这些新ZFN测试的覆盖面是否刚刚好。比如,采用带有标记的病毒颗粒的方法可能会遗失一些脱靶切割,因为病毒标记可能并不结合到每个单裂口。再者,不同于试管中的DNA,细胞DNA紧密缠绕成染色质,因而在试管方法中发现的很多结合位点可能在活细胞得到保护并且从不会被ZFNs切割。

总之,ZFNs虽然具有高度特异性和精确性,但是也有打盹的时候,也会在发生极低概率的脱靶事件,在错误的DNA序列上发生切割,但是上述两种系统性地研究这种脱靶作用的方法结果表明在全基因组范围内,ZFNs错误切割另一种序列几乎相同的基因的概率大约为2万分之一,以及甚至更低概率地切割少数几个其他的类似序列。但是这一切都是在研究人员们采用一种极度高浓度的ZFN和极易允许ZFN作用的细胞系的条件下进行的,目的是观察最糟糕的情形会是什么样子。实际情形,发生错配的概率肯定更低。不过相对于HIV和常常复发的恶性多形性成胶质细胞瘤治疗而言,这种极低的脱靶事件还是能够容忍的。比如,Sangamo生物技术公司开发的用于治疗HIV的ZFNs药物以及用于治疗复发性多形性成胶质细胞瘤(recurrent glioblastoma multiforme)的ZFNs药物也都已经进入临床I期,另外该公司正在人类安全性试验中测试一种治疗HIV的候选药物,其中该试验利用一种ZFN修饰HIV用来侵入细胞的T细胞受体CCR-5。(生物谷:towersimper编著和整理)

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