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生物标记三部曲:绿色荧光蛋白、辣根过氧化物酶和小型单线态氧制造者

来源:生命科学论坛 2011-07-26 10:29

生物标记三部曲:绿色荧光蛋白(GFP)、辣根过氧化物酶(HRP)和小型单线态氧制造者(MiniSOG)

【towersimper注:本文为译文,每篇都有部分改动,仅用作研究之用,不得用作商业开发,转载请标明翻译者towersimper,第一篇来自Sowmya Swaminathan, Nature Cell Biology, "GFP: the green revolution", doi:10.1038/ncb1953, October 1, 2009;

第二篇来自Andy, brainslab.wordpress.com,"Horseradish peroxidase as marker for anatomical em", April 3, 2011;

第三篇来自Andy, brainslab.wordpress.com, "MiniSOG, a light and electron microscopy fusable marker", April 16, 2011】

第一篇:绿色荧光蛋白: 绿色革命


来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的两个触觉感受器神经元的细胞体(cell body)用编码β-微管蛋白的基因表达的绿色荧光蛋白标记,图片来自doi:10.1126/science.8303295.

1994年,Chalfie等人在Science杂志发表一篇报道,表明来自维多利亚水母(Aequorea Victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP),在没有任何A. Victoria的辅助因子存在下,能在活着的细菌和线虫细胞中用作蛋白定位和表达的标记。这种显示GFP作为体内研究蛋白的工具基本上改变了细胞生物学家能够解决的问题的性质和范围。

1962年,Shimomura和他的同事们在A. victoria生物发光蛋白水母素(aequorin)的纯化过程中偶然间第一次发现了GFP。1974年,Morise和他的同事们在随后的纯化、晶体形成和从水母素到GFP能量转移的体外重建过程中,为GFP的荧光性质提供启迪,而且证实GFP接受来自水母素的能量转移后发射绿光。

在此之后许多年,在外源系统中GFP是否需要水母素和可能来自水母的其他因子发出荧光,这仍然是一个公开的问题。1992年,也就是在GFP发现后的30年,Prasher等人克隆了编码GFP的基因,就为实验上评估它用作蛋白质的体内标记铺平道路。而在两年后,Chalfie等人证实当GFP在细菌和线虫细胞中表达时,它能够发出荧光。在线虫中,GFP是在一个表达β-微管蛋白的基因启动子的控制下表达的。它在线虫特异性神经元中的时空表达模拟了内源性β-微管蛋白基因的表达,因而证明GFP能够作为一种可靠的标记以便监控基因表达模式。此后不久,Roger Tsien的实验室对天然GFP进行改造使之变得更加明亮和耐光,以及在一个与常规显微镜过滤器装置相匹配的波长下激发,因而增加了它的实际适应性。GFP技术的下一个突破便是开发GFP变异体产生蓝色、青色和黄色荧光蛋白,因而能够使得影像实验在细胞和有机体中采用多种标记的蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)是由238个氨基酸残基组成,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色荧光。而EGFP是增强型的GFP (enhanced GFP),发生了双氨基酸取代,亮氨酸(Leu)取代GFP上第64位苯丙氨酸(Phe),苏氨酸(Thr)取代了GFP上的第65位丝氨酸(Ser),与GFP相比,具有更强更稳定的绿色荧光。黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)其序列与GFP基本相同,不同之处就是把第203位Thr以Tyr取代,这样的GFP不发出绿色荧光,而发出较长波长的黄色荧光。青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)与此类似,也是GFP第66位Tyr(酪氨酸)被Thr(色氨酸)所取代的结果,发青色荧光。由此可见,GFP标签与其它突变体GFP、YFP、EYFP、CFP的序列非常的类似,只有1-2个氨基酸残基的变化。

在GFP发现后的将近半个世纪以来,因为发现和开发绿色荧光蛋白,2008年诺贝尔化学奖被授予给Osamu Shimomura, Martin Chalfie和Roger Tsien,来表彰这次发现给后世带来的巨大影响。

参考文献:

Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. & Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263, 802–805 (1994).

Shimomura, O., Johnson, F. H. & Saiga, Y., Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223–239 (1962).

Morise, H., Shimomura, O., Johnson, F. H. & Winant, J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. Biochemistry 13, 2656–2662 (1974).

Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G. & Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111, 229–233 (1992).

Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509–544 (1998).

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第二篇:辣根过氧化物酶作为解剖学电子显微镜(anatomical electron microscopy)的标记

要绘制诸如视网膜的大容量组织中的突触联系(synaptic connection) James R. Anderson等人于2009年就已经主张应当将分子表达谱(molecular profiling)与电子显微镜图片相关联。

如今,这里给出一个例子来说明分子表达谱仪(molecular profiler)如何得到很好的利用。Jianli Li等人[1]采用电穿孔技术产生将携带有靶向到细胞膜的辣根过氧化物酶(membrane-targeted horseradish peroxidase, mHRP)基因的表达构建物导入神经元。辣根过氧化物酶发射可放大的波长为428nm的荧光。这些研究人员就使用它作为解剖学上的标记,与蝌蚪神经元的连续切片电子显微镜图片(serial section electron microscopy, SCEM)在空间上相互关联。

辣根过氧化物酶的优势之一在于它在包括线粒体/小泡(vesicle)在内的细胞膜上均匀分布。它也有助于鉴定长轴突(axon)/小直径的树突(dendrite)。但是另一方面,不同于其他的标记,它不得不在动物仍然活着的时候通过电穿孔技术导入细胞才有效果。

下面是一系列电子显微镜图片,其中远侧树突分支(distal dendritic branch),蓝色显示;带有轴突末端(axon terminal, 用粉红色显示)的突触,用白色箭头符号指示:

比例尺=1微米

当从向右观看这一系列图片时,你能够看到树突如何缩减,而研究人员能够在他们的微回路(microcircuit)模型中重构这些图片。

为了鉴定突触,这些研究人员使用了两种主要策略:

1) 至少进行两次连续切片,在每次切片中,锚定和成簇突触小泡与紧邻神经元的细胞膜相对。

2) 在突触位点处的前突触膜(presynaptic membrane)细胞内部分到后突触膜(postsynaptic membrane)细胞质的距离应当要比非突触位点处的距离显著性地长。与这一致的是,在突触位点处的前突触膜和突触间隙(synaptic cleft)电子致密物(electron dense material)应当要比非突触位点处的相应物质更加茂密。

下面的图表量化突触位点和非突触位点处的平均膜厚度,尽管在表达辣根过氧化物酶的神经元中这些差异实际略微不是很明显:

参考文献:

Li J, Wang Y, Chiu S and Cline HT (2010) Membrane targeted horseradish peroxidase as a marker for correlative fluorescence and electron microscopy studies. Front. Neural Circuits doi:10.3389/neuro.04.006.2010.

第三篇:一种可融合的光学显微镜和电子显微镜标记:小型单线态氧制造者(MiniSOG)

1994年绿色荧光蛋白在外源系统表达在光学显微镜领域引发一场“绿色革命”,允许研究人员在细胞中可视化单个蛋白分子。

在最近的一份研究论文中,Shu et al.首先回顾了试图为电子显微镜生产类似分子,如辣根过氧化物酶,但是他们作出结论,它们全部都有严重性的缺点。他们随后报道了他们构建的一种称作小型单线态氧制造者(mini singlet oxygen generator, miniSOG)的蛋白分子,它是对来自植物拟南芥天然蛋白向光色素-2(phototropin-2)的一部分进行基因改造而成,能够非常像从水母中获得的基因编码的荧光蛋白家族一样进行使用,同时也是一种有效的氧气制造者。这种蛋白的唯一辅因子是黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN),而FMN是线粒体电子传递链所必需的,因而几乎在所有的细胞中存在。

在培养的HeLa细胞中,他们将miniSOG与细胞色素C融合在一起,证实表达这个分子能够在光学显微镜和电子显微镜下标记线粒体,如下图所示:

J = 光氧化之前的共聚焦显微图片,K = 光氧化之后的透射光显微图片; 箭符号=表达miniSOG的细胞,箭头符号=不表达miniSOG的细胞;L / M = 电子显微镜,注意一下线粒体的外膜、内膜和嵴(cristae)保存完好的形态;图片来自doi:10.1371/journal.pbio.1001041。

研究人员也将miniSOG与一种SynCAM同工型(isoform)融合在一起,而SynCAM是一种促进突触组装的细胞粘附蛋白,预期定位在后突触。他们然后使用串联黑体扫描电子显微镜(serial block face scanning electron microscopy)观察小鼠组织来确定标记物miniSOG三维空间中的位置。

唯一问题就是“miniSOG革命”是否如同“绿色革命”这个名字一样容易让人记住。

参考文献:

Shu X, Lev-Ram V, Deerinck TJ, Qi Y, Ramko EB, et al. (2011) A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS Biol, 9(4): e1001041. doi:10.1371/journal.pbio.1001041

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