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白细胞介素-2(IL-2)生物学活性测定

来源:来源网络 2007-08-27 22:35

实验目的
1.掌握IL-2生物学活性测定的原理。
2.熟悉IL-2生物学活性测定的实验方法和结果计算。
实验原理
IL-2是由Th细胞产生的淋巴因子,在淋巴细胞增殖分化过程中起到非常重要的作用。IL-2活性测定基于IL-2能维持IL-2依赖细胞的代谢和存活,促进这类细胞的增殖。细胞在增殖时能量代谢活跃,可产生大量的能量以供合成多种大分子物质和细胞分裂所需,能量代谢的水平与细胞合成DNA水平基本平行,因此,测定细胞能量代谢的水平可以间接地反映细胞增殖情况。
MTT(四甲基偶氮唑盐)是一种淡黄色的水溶性化合物,活细胞(特别是增殖期的细胞)通过线粒体能量代谢过程中的琥珀酸脱氢酶的作用,使淡黄色的MTT分解产生蓝色结晶状甲臢沉积于细胞内或细胞周围,且形成甲臢的量与细胞增殖程度呈正比,甲臢经SDS作用后可溶解显色。溶解液的光密度值与细胞代谢及IL-2活性正相关。
实验材料
1.1640培养液(完全)、IL-2标准品、待测IL-2样品、CTLL-2细胞株、MTT溶液(5mg/ml)、10%SDS
2.96孔细胞培养板、多头细胞收集器、微量加样器、CO2孵箱、酶标仪
实验方法
1.制备CTLL-2细胞悬液  取生长旺盛的CTLL-2细胞,用1640培养液将细胞洗3次,用完全1640培养液配成2×105/ml细胞悬液。
2.稀释样品和标准品  将待测样品和标准IL-2用完全1640培养液做一定的倍比稀释。
3.加样与检测  向96孔细胞培养板内加入不同稀释度的样品和标准品(50μl/孔),每稀释度3个复孔,并设细胞对照。再向各孔加入50μl细胞悬液,混匀,置5%CO237℃培养36小时,每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6~8小时后,每孔再加10%SDS100μl,充分混匀,37℃孵箱静放(使甲臢全溶解)。在酶联仪上选波长570nm测定OD值,将待测样品的OD值与标准品OD值比较后,求得待测样品的IL-2活性单位。
结果计算
将各稀释度的OD值按照样品最大增殖OD值的百分比换算成概率单位,可将原来呈S形的曲线转换成为直线。根据这些点的数据求出各直线的回归方程。再从回归方程求出各样品达50%最大增殖时的稀释度,而后按下列公式求出待测样品IL-2的活性单位。
计算公式:
 x  待测样品IL-2活性单位(μ/ml);  a:标准参考样品IL-2的活性单位(μ/ml);
 d  待测样品达50%最大增殖的稀释度;  D:标准参考样品在50%最大增殖的稀释度。
注意事项
1.  MTT液要现配现用,避免光照,若有蓝色颗粒需过滤后再用。
2.  生物学测定法敏感性高,特异性强,所测IL-2是具有生物活性的IL-2,而不象免疫学测定法所测定免疫反应性IL-2蛋白,因此测定的条件和要求要严格按规程。
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