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附录三 全血细胞培养染色技术常用试剂配制

来源:www.bioon.com 2007-08-08 21:57

附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制

  一、国内实验室应用试剂配制

  (一)培养液

  (1)RPMI1640培养液:称取RPMI培养基9.8g,碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml,加双蒸水至1000ml,调节 pH7.2~7.4无菌过滤冻存备用。

  (2)小牛血清商品:成都生物制品厂。

  (3)植物凝集素(PHA):自制或成品(重庆药检所)。

  (4)pH调整液:5%NaHCO3溶液高压灭菌(8磅15min),0.1N稀盐酸液100ml。

  (5)秋水仙素:10mg/ml无菌过滤高压灭菌(8磅10min)。

  (6)磷酸缓冲液:pH7.4。

  磷酸氢二钠28.8g(H2O)、磷酸二氢钾2.67g(无水),溶于1000ml双蒸水中,加肝素,终浓度为100u/ml。

  (7)Giemsa染色液:

  Giemsa粉剂           1g

  甘油              66ml

  在研钵中,加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨,60℃温箱中保温2h,冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍,随配随用。

  (二)固定液

  (1)甲酸:冰乙酸3:1混合即用。

  (2)PBS缓冲液配制:

  NaCl   16g   Na2HPO4(12H2O)  5.65g

  KCl   0.4g  KH2PO4        0.4g

  加双蒸水至1000ml pH7.0。

  取5%胰酶(生理盐水配制)1ml加入50ml PBS液中(最终浓度为0.025%),4℃冰箱待用。

  二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)

  1.完全培养基

  RPMI             76.0ml

  胎牛血清           20.0ml

  植物凝集素          2.0ml

  抗生素/抗菌素溶液(100×)  1.0ml

  L-谷氨酰胺(100×)     1.0ml

  2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine, 5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中,0.2μm滤膜过滤除菌,分装后-20℃储存,BudR要在柔光(弱光)下操作。

  3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)  按250μg/ml溶解于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。

  4.Colcemid(Sigma)  5.0μg/ml溶于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。

  5.KCl(0.75mol/L)  溶解560mg于100ml dH2O中,新鲜配制37℃保存。

  6.固定剂  甲醇冰醋酸按3:1(V/V)混合即可,现用现配,置冰上待用。

  7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)

  8.生物素7-dATP(BRL)

  9.糖原(BRL)

  10.RNA酶A(Sigma)

  (1)储备液

  称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中,置沸水中煮10min,分装后储于-20℃。

  (2)工作液

  用储备液按1:100稀释。

  11.20×SSC

  NaCl            175g

  柠檬酸三钠         88g

  dH2O           1000ml

  固定试剂溶解后,dH2O定容至1000ml,调pH至7.4,高压灭菌。

  12.杂交液(高深度,HMmix)

  去离子甲酰胺          6.0ml

  100×Denhardt’s液      1.0ml

  50%硫酸葡聚糖         2.0ml

  1%人或鲑精DNA

  20×SSC

  ※:临用前加入,终浓度为100~200μg/ml。

  该液为高浓度杂交液, 存于4℃。

  13.PBT液

  BSA            5%

  Triston X-100/(PBS)   0.1%

  注:BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

  14.兔抗生物素(α-生物素)单克隆抗体

  用PBT液1:100稀释。

  该单抗现可从英国Dako公司购得。

  15.金(10~20nm)标羊抗兔二抗

  用PBT液1:50稀释。

  16.银溶液(Janesen)

  17.Hoedst 33258(Sigma)

  储备液(100×)

  Hoedst染料           5mg

  甲醇              10ml

  工作液:用2×SSC 1:100稀释储备液。

(吴康 蔡文琴)

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