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重组蛋白和多肽的分离纯化(7)

来源:来源网络 2007-08-04 20:23

2.2.2.3 常用的一些亲和标签

       4 列出了常用的亲和融合系统和各自的洗脱条件,以及各种亲和标签的特点(91,92,93),下面就几种常用的亲和标签进行介绍,需要了解更多的标签可参阅Hearn等的综述(91)。

1   His表位标签和金属螯合亲和层析

    金属螯和亲和层析技术是由Porath及其合作者在70年代中期发展起来的,这一方法基于蛋白质表面的一些特定的氨基酸残基侧链,尤其是组氨酸,在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用,如Ni2+Zn2+Co2+,目前His标签已经成为应用最为广泛的亲和标签。它的主要优点如下:1 标签的分子量小,一般不影响目标蛋白的功能;2  His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性,前面已作了介绍;3 His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;4 His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体;5 可应用于多种表达系统,纯化的条件温和;6 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。His标签也有一些缺点,如融合蛋白易形成包涵体,包涵体蛋白难于溶解,融合蛋白溶解后不能正确复性,层析时螯和的金属离子容易泄漏(会使蛋白的氨基酸侧链氧化,纯化的得率降低,制品中残留金属离子对细胞、组织有毒性),金属鳌和亲和层析的非特异性结合会造成制品的纯度不高,针对这些问题,现在发展的 His亲和表达纯化系统克服了其中的某些缺点,如使用结合金属离子强的亲和介质Ni-NTATALON,使用HAT标签(HAT标签为鸡乳酸脱氢酶的一段序列),六个组氨酸被其它氨基酸隔开,没有正电荷聚集的现象,可改善溶解性和得率。硫氧还蛋白(thioredoxin)作为融合标签可以促进蛋白的可溶性表达,Lu等将硫氧还蛋白表面的4个氨基酸残基进行系统性的突变,发现E30HQ62H两个组氨酸突变可以使硫氧还蛋白螯和固定化的镍离子,S1H突变可以进一步促进这种相互作用,从而给硫氧还蛋白打上一个组氨酸补丁(histine patch),同时保留了野生型分子促进可溶性表达的能力,突变蛋白hpTrxA和野生型硫氧还蛋白融合表达的水平相一致,并能用金属螯和层析方便的进行融合蛋白的纯化(104)。

在亲和纯化中,常规使用的介质有Ni-IDANi-NTATALON亲和介质,图6 画出了相应三种螯和配体的化学结构,最早使用的IDANi2+有三个结合位点,结合位点在一个平面上,结合力也最弱,所以在纯化中的泄漏也最多,NTANi2+4个结合位点,TALONCo2+也有4个结合位点,形成立体的结合,结合力较强,泄漏也较少。根据产品的介绍,TALON对蛋白质组氨酸的排列有要求,为相邻的组氨酸或处于特殊位置的两个组氨酸,而这一点对Ni-NTA则不那么严格,所以TALONHis标签融合蛋白的选择性也就更高,非特异性蛋白结合就更少。

       6 用于金属螯和层析的螯和配体。结合位点的原子用圆形边框注释,sp代表间隔臂,M代表基质。

2  谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签

   谷胱甘肽巯基转移酶蛋白(GST)标签是最早使用的亲和标签,目标蛋白加于GSTC端,再利用谷胱甘肽亲和介质进行纯化,或固定在亲和介质上进行蛋白质-蛋白质相互作用研究,GST pulldown实验已经成为研究蛋白质相互作用的常用方法。用于亲和纯化的GST来源于日本血吸虫,由于其分子量较大,而且以二聚体的形式存在溶液中,一般都需要去除融合标签。这一系统必须依赖于GST的正确折叠,幸运的是一般GST融合蛋白包涵体在溶解复性后都能正确折叠。GST融合蛋白也常用来免疫动物生产抗体,以及作为载体蛋白进行一些蛋白的结晶。GST标签常被选择用于增加可溶性表达,但实际上并不有效, Waugh的小组选择了10个可溶性表达不好的蛋白作为研究对象,GST融合并不能增强负载蛋白的可溶性表达(103,106)。

3  基于Protein AProtein G的亲和标签

   Protein A广泛的用于纯化IgG分子,它是金黄色葡萄球菌的细胞壁成分,可以特异性的结合免疫球蛋白的Fc区。Protein A前体蛋白由信号肽序列、5个同源的IgG结合结构域和细胞表面锚定序列组成,同源的5IgG结合结构域能够分别结合IgGProtein A已广泛的用于抗体的纯化。作为亲和融合的标签,Protein A具有以下优点:1 在各种宿主细胞中,Protein A耐蛋白酶的降解,高度稳定;2 每个IgG结合结构域形成3螺旋捆状结构,两端都是亲水的结构,使得Protein A的折叠不依赖于目的蛋白的折叠;3 Protein A不含有半胱氨酸,否者可能干扰目的蛋白二硫键的形成;3 Protein A高度可溶,在变性条件下复性的效率高,有助于融合蛋白包涵体的溶解和折叠;4 可引入不同的酶切位点,不影响目标蛋白的酶切;5 加上信号肽序列,可使融合蛋白进行大肠杆菌周质表达,某些情况下,可进行胞外表达。为了使融合蛋白耐溴化氰和羟胺处理,对5IgG结合结构域中的B结构域进行了结构改造,替换了溴化氰和羟胺处理敏感的氨基酸,就有了Z标签,越来越多的应用更优先选用Z标签和它的双体ZZ标签。除了大肠杆菌以外,在其它的表达系统(酵母、植物细胞、昆虫细胞、CHO细胞)中已成功的表达了Protein AZZ融合蛋白。由于基于Protein A的亲和标签的亲和性比较高,要在相对剧烈的条件下(低pH)进行洗脱,所以可能造成目标蛋白的失活,另一个问题就是IgG亲和层析介质较贵,并且不耐清洗处理。Gülich等对Protein A进行了结构改造,降低结合的强度,使洗脱的pH值升高到4.5102)。

链球菌Protein G是存在于某些链球菌菌株表面的双功能受体,可以同时结合IgG和白蛋白,并且这两段功能区域在结构上分离。白蛋白结合区域在大肠杆菌中表达高度可溶,性质稳定,不被蛋白酶降解,结合上信号肽能有效的分泌。这一区域的不同部分BBABPABD被用于一步人白蛋白亲和层析纯化(结合有种属特异性,对人的白蛋白结合最强),并在多种表达系统中得到应用。基于Protein G的亲和标签最重要的用途在于传输蛋白质药物,融合蛋白的白蛋白结合特性使得目标蛋白的血浆半衰期延长,增强了疗效。BB融合标签还可以刺激目的蛋白的抗体响应,可用于免疫动物生产抗体。

4  能与抗生物素蛋白特异性结合的亲和标签

   生物素-抗生物素蛋白(Avidin-Biotin)是目前所知的最强的亲和作用之一,其解离常数Kd10-15M,然而太强的结合使得重组蛋白很难在相对温和的条件下洗脱下来,所以需要在亲和标签/配体对的特异性和解离常数之间寻找一个平衡。体外也可对蛋白赖氨酸残基进行生物素化标记,但不具有特异性,不能用于亲和纯化,研究者转向寻找体内可特异性生物素化的多肽,并把它用于亲和融合策略。

    很少有蛋白在体内可以被生物素化修饰,乙酰辅酶A的生物素羧基载体蛋白(BCCP)是存在于大肠杆菌(E. coli)的唯一一个可生物素化蛋白,生物素在生物素连接酶(BirA)的催化下特异性的修饰其中的一个赖氨酸残基,研究表明其C末段101个氨基酸的肽段已经具有可被生物素化的功能,PromegaPinPoint载体就编码这个标签,使用其SoftLink亲和素(即抗生物素蛋白)介质可以在弱的条件下洗脱融合蛋白(5mM生物素溶液)。

    Strep Tag 系统是通过筛选噬菌体随机肽库而得到的短肽(含9个氨基酸残基),将其进行目标蛋白的C端融合可以模拟生物素和链霉抗生物素蛋白特异性相互作用,使用亚胺生物素洗脱。这一系统不能进行N端融合,而且变性剂会影响亲和相互作用。后来发展的8氨基酸Strep tag Ⅱ标签,与Strep Tag相似,本身并不能生物素化,但却可以模拟生物素的功能和链霉抗生物素蛋白变体Strep-Tactin特异性的相互作用,可加在蛋白的N端和C端,使用便宜的脱硫生物素进行洗脱,而且Strep tag Ⅱ和Strep-Tactin相互作用不受变性剂的影响,可在变性条件下纯化。

    AviTag由筛选肽库得到15 个氨基酸的短肽,具有一个单生物素化赖氨酸位点,与已知天然可生物素化一致序列完全不同,可以加在目标蛋白的N端和C端,融合表达后,可被生物素连接酶BirA(细菌具有内源性的生物素连接酶,但为了使重组蛋白完全生物素化,感受态细菌已转化高水平表达生物素连接酶的质粒)生物素化,为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物,除了用于蛋白质分离纯化,还用于蛋白质相互作用研究。

5   麦芽糖结合蛋白(MBP

    大肠杆菌麦芽糖结合蛋白是malE基因的产物,定位在细胞的周质空间,可以特异性的结合麦芽糖或糊精-麦芽糖复合物,协助这些物质转运到细胞内。这一系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化,用麦芽糖进行竞争性洗脱,具有如下优点:1 MBP不含有半胱氨酸残基,不会干扰目标蛋白形成正确的二硫键;2 使用的介质价格低廉;3 可以在温和的条件下洗脱融合蛋白;4 加上其分泌信号,可以进行分泌表达在细胞周质,由于周质是偏氧化的环境,可以促进目标蛋白形成正确的二硫键;5 这一系统最显著的特点是与麦芽糖结合蛋白(MBP)进行融合表达可以改善目标蛋白的溶解性,促进正确折叠,提高活性蛋白的回收率,实验证明MBP比硫氧还蛋白和GST都要有效(103,106)。与硫氧还蛋白不同,MBP进行C端融合也可以促进蛋白的可溶性表达(107),扩展了MBP的应用。一般认为MBP促进可溶性表达与它具有分子伴侣样的特性有关,MBP可以直接的和折叠中间体相互作用,抑制聚集的发生,从而使它区别于别的标签(103,109,110)。

6           钙调蛋白结合肽(CBP

    钙调蛋白结合肽(CBP)有26个氨基酸残基,来源于骨骼肌肌球蛋白轻链激酶C末段,钙调蛋白结合肽与钙调素结合是Ca2+依赖的,这种结合不受标签所处的位置影响(N端和C端均可),在中性pH条件下使用2mM EGTA可以很方便的将目标蛋白洗脱下来。这一系统有如下优点:1 特异性很高,因为大肠杆菌没有可以和钙调素结合的蛋白;2 His标签相比可以在强还原性条件下纯化。

7           纤维素结合肽(CBD

    纤维素结合肽(CBD)融合蛋白能与纤维素介质特异性的结合,可以在温和的条件下洗脱(乙二醇或低盐条件),pET CBD 载体含有纤维素结合肽(CBD)的序列,可方便克隆构建。

8           几丁质结合肽

    New England Biolabs 提供的IMPACTIntein-Mediated Purification with an affinity Chitin-binding Tag)系统使用几丁质结合肽(来源于环状芽胞杆菌)作为融合标签,表达的融合蛋白可以用几丁质亲和层析纯化,利用内含肽(intein)的特异性原位剪切直接获得目标蛋白。这一系统包括以下几类:1 巯基诱导的N端剪切系统(相对内含肽来讲),有pTYB1和其衍生载体,使用的内含肽来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeVMA1基因,将最后一个氨基酸进行了N454A突变,使内含肽的C端不能被剪切,在巯基试剂的诱导下,内含肽的N端发生重排、裂解、水解,就得到目标蛋白,由于细菌表达,目标蛋白N端有甲硫氨酸,C端不引入额外的氨基酸残基;2 巯基诱导的C端剪切系统,有pTYB11pTYB12载体,同样使用来源于酿酒酵母VMA1基因的内含肽,内含肽C端的剪切依赖于其N端剪切位点的巯基诱导裂解,几丁质结合肽序列插入到内含肽的核酸内切酶结构域,N端为半胱氨酸的蛋白不能使用这一系统剪切;3 pH诱导的C端剪切系统,有pTWIN 载体,内含肽来源于一种蓝细菌的dnaB基因,有429个氨基酸残基,N端的半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代,使内含肽不具有N端的裂解活性,而保留C末端pH诱导剪切的特性,当pH6.0-7.5,剪切能有效进行,pH<5.5pH>8.0剪切可被有效的阻止,内含肽的N端融合几丁质结合肽,C端融合目标序列,在pH8.5纯化融合蛋白,在pH 6.0-7.04-25条件下剪切; 4可以用于蛋白质环化的双内含肽系统,目的蛋白处于两个内含肽之间,先通过pH诱导目标蛋白N端内含肽被剪切,再用巯基试剂诱导C端内含肽被剪切,剪切后产生N端为半胱氨酸残基和C端为硫脂键的蛋白,通过自发的缩合可形成环化蛋白。与传统的亲和融合系统相比,这一系统的最大优点在于不需要使用蛋白酶来去除融合标签。

9  FLAG表位标签,T7表位标签和S标签

   FLAG肽序列(DYKDDDDK)的亲水性很强,片段小,并且具有肠激酶的酶切位点,一般不会影响目标蛋白的活性。FLAG标签的最初用途是用于蛋白检测,可以在飞摩尔水平特异性检测目标蛋白,Sigma3FLAG表位(DYKD)串联,中间以两个氨基酸间隔,可以将蛋白分析灵敏度提高10-20倍。抗FLAG的单克隆抗体M1FLAG结合是Ca2+依赖的,加入螯和剂可以在温和的条件下将融合蛋白洗脱,但M1 抗体只能结合处在N端最外面的FLAG标签,所以只可用于去除信号肽后的FLAG融合蛋白。筛选的M2抗体可以和前面多一个甲硫氨酸的FLAG标签或C端的FLAG标签结合,但这种结合是Ca2+非依赖的,需要使用低pH洗脱,或用合成的FLAG肽进行竞争性洗脱。这一系统可在多种表达系统中使用,主要的缺点是M1M2亲和介质特别昂贵。

T7 标签为T7 基因10蛋白的最前面11个氨基酸,通过免疫亲和层析进行纯化。S标签为15 个氨基酸的多肽标签,可以特异性的和S-蛋白介质结合。由于S标签和S-蛋白结合形成有活性的核糖核酸酶,可以灵敏的定量检测融合蛋白。

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