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重组蛋白和多肽的分离纯化(5)

来源:来源网络 2007-08-04 20:17

2.2.2.2 亲和标签的去除

尽管亲和融合策略可以一步使融合蛋白的纯度达到很高,但是在蛋白质的下游处理阶段又引入了新的问题,即需要位点特异的剪切。在进行融合表达时,以下三种情况是不必去除亲和标签:1. 目标蛋白作为免疫原用来产生和纯化抗体;2. 目标蛋白的生物活性不受融合标签的影响;3. 目标蛋白用来直接固定化在介质上。但如果亲和标签影响了目标蛋白的功能,或为了结构生物学研究和治疗用途,就必须在融合标签和目标蛋白之间加入特异的剪切位点,以便去除亲和标签,可用的方法有化学法和酶法,如表5 所示,在选择这些方法时除要考虑选择性等因素外,还要考虑标签去除后氨基酸的残留 ,目前C端的标签没有很好的方法去除,都会在目标蛋白的C端引入额外的氨基酸,针对N端标签已有几种蛋白酶在酶切后可使目标蛋白不带额外的氨基酸残基。化学方法廉价,但是常缺乏选择性,而且使用剧烈的反应条件常使目标蛋白变性失活,使用蛋白酶的优点是反应的条件温和(中性pH,温度为4℃到37℃),特异性强。如果使用蛋白酶进行特异性剪切,在酶切完成后要有相应去除蛋白酶的纯化方法,有的重组蛋白酶具有亲和标签,如N端带有His标签的肠激酶、二肽氨基肽酶和TEV蛋白酶,可在酶切后使用金属螯合亲和层析去除,N端带有GST标签的PreScission蛋白酶,可以用谷胱甘肽亲和层析柱去除,还可以将蛋白酶固定化在介质上进行融合蛋白的酶切,使蛋白酶可重复使用。尽管如此,在进行融合蛋白的酶切时会遇到一些特殊的问题,如酶切的效率受到酶切位点空间可及性和周围氨基酸性质的影响,常存在酶切不完全的现象;某些蛋白在酶切后会出现沉淀;使用内肽酶可引起非特异性剪切的情况,如凝血酶属于丝氨酸蛋白酶,在精氨酸和赖氨酸残基后剪切,最优的酶切位点为P4-P3-Pro-ArgP1’-P2’P4P3为疏水性氨基酸,P1’P2’ 为非酸性氨基酸),非特性酶切的情况在表5的注释里作了说明,而应用广泛的肠激酶也存在非特异性酶切的现象(92,97)。Jenny等对凝血酶和凝血因子Ⅹa蛋白酶的应用进行了综述,认为尽管它们在很多应用中能够在设计的位点进行特异性酶切,但常常会发生目标蛋白其它位点的酶解,所以在去除亲和标签后要对目标蛋白进行鉴定,以确保蛋白的结构没有发生变化(105)。正是由于酶切以及成本方面的考虑,亲和融合策略在工业上应用并不广泛。

5 融合蛋白的剪切方法

剪切的方法

剪切位点序列

注释

 化学法

溴化氰

Met^

需要70%甲酸,室温

羟胺

Asn^Gly

pH9条件下,需要加热,45

甲酸

Asp^Pro

70%甲酸,需要加热

                                    酶法

肠激酶

Asp-Asp-Asp-Asp-Lys^

重组的蛋白酶,为内切酶,如果在赖氨酸后为脯氨酸则不能剪切,在其它的碱性氨基酸残基后有非特异性剪切,具有活性的pH范围为4.59.5,温度范围为4℃到45

凝血因子Ⅹa蛋白酶

Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^

如果在精氨酸后为脯氨酸和精氨酸则不能剪切,为内切酶,在Gly-Arg后存在非特异性剪切

凝血酶

Leu-Val-Pro-Arg^Gly-Ser

牛来源的含有其它蛋白质,为内切酶,存在非特异性的剪切,生物素化后可用链霉抗生物素蛋白亲和层析清除

PreScission 蛋白酶

Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln^Gly-Pro

GST融合的鼻病毒3C蛋白酶,为内切酶,4具有最优活性

rTEV蛋白酶

Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln^Gly

重组的烟草蚀纹病毒蛋白酶,具有8个氨基酸识别位点,高特异性,为内切酶,在宽的温度范围里具有活性,与His-tag融合后,酶切后使用金属螯合亲和层析清除

二肽基氨基肽酶

(Xaa)2n^Xaa-Pro, (Xaa)2n^Xaa- Xaa –Pro,  (Xaa)2n^Lys/Arg/Gln

为外切酶,当终止氨基酸为Gln时,可在谷氨酰胺环转移酶和焦谷氨酰胺肽酶的作用下去掉Gln,可产生天然的目标蛋白质,特异性强

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