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体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验- 中华仓鼠肺细胞染色体突变实验

来源:丁香园论坛 2007-03-10 20:46

药物毒理体外经典实验。国家都有标准了就可以想象重要性了。自己做了一个PDF文件,方便大家收藏。
中华人民共和国国家标准
GB 15193.12一91
体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验
V79/HGPRT gene mutation test
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1  主体内容与适用范围
1.1  本标准规定了体外哺乳类细胞(V79/HGPRT)基因突变试验的基本技术要求。
1.2  本标准适用于需要进行食品安全性评价的用作或用于食品的化学物质。
2  原理
2.1  细胞在正常培养条件下,对6-TG的毒性作用敏感,不能生存,在致癌物和致突变物作用下,某些细胞X染色体上控制次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的结构基因发生突变,不能再产生HG-PRT,从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用。这些突变细胞在含有6-TG的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数,计算突变率以判定受试物的致突变性。
3  材料和试剂
3.1  细胞:使用中国仓鼠肺(v79)细胞株。为了减少自发突变率,正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自发HGPRT座位突变体选择性杀灭,方法是将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸腺嘧啶,氨甲氨甲喋呤,甘氨酸的MEM培养液中培养1周,然后重新接种于MEM培养液中。
3.2  培养液:采用MEM(Eagle)基础培养液或DMEM培养液,补以10%小牛血清及适量抗菌素(青霉素,链霉素)。
3.3  磷酸缓冲液(无钙、镁PBS)
磷酸二氢钾
(KH2PO4)  0.2 g
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)  2.89 g
氯化钾
(Kcl)  0.2 g
氯化钠
(NaCl)  8.0 g
双蒸水  1000 mL
高压消毒,121℃,0.103 MPa,20 min。
3.4  胰蛋白酶/EDTA溶液:用无钙、镁PBS配制,胰酶的浓度为0.05%,EDTA的浓度为0.02%,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃贮存。
3.5  受试物:最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚砜(DMSO),其浓度应低于0.5%(v/v)。
3.6  阳性对照物:可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物,例如甲基磺酸乙酯(EMS),丝裂酶素C(MMC),甲基硝基亚硝基肌(MNNG),苯并芘(BP)等。
3.7  6-TG用0.5%碳酸氢钠溶液配成1.0 mg/ml,4℃贮存。
3.8  大鼠肝匀浆S-9混合物,按Ames试验程序制备。
4  实验步骤
4.1  细胞准备:将5X105个细胞接种于直径为100 mm平皿中,于37℃,5%二氧化碳培养箱中放置 24h.
4.2  接触受试物:吸去培养液,PBS洗两次,加入无血清培养液及一定浓度的受试物(需代谢活化者同时加人大鼠肝匀浆S-9混合物),置于培养箱中2h,结束后吸去含受试物的培养液,用PBS洗细胞两次,换入含10%血清的培养液,继续培养19~22 h。
4.3  表达:接触受试物的细胞继续培养19~22h后用胰酶。EDTA消化,待细胞脱落后,加入含10%血清培养液终止消化,混匀,放入离心管以800~1000 r/min的速度离心5~7min,弃去上清液,制成细胞悬液,计数,以5×105个细胞接种于直径为100mm的平皿,3d后分传一次,仍接种5x105个细胞培养3d。
4.4  细胞毒性测定:将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个,每组5个皿,37℃,5%二氧化碳条件下培养7d,固定,Giemsa,染色,计数每皿集落数,以相对于溶剂对照组的集落形成率表示细胞毒性、即以溶剂对照的集落形成率力100%(1.00),求出各检品试验组的相对值。
B
A(%)=---×1000 ………………………(1)
C
    式中:A——相对集落形成率;
   B——试验组集落形成率;
C——溶剂对照组集落形成率。
4.5  突变体的选择及集落形成率的测定:表达结束后,消化细胞 分种,每组5个皿,每皿种2x105 个细胞,待细胞贴壁后加入6-TG,终浓度为5μg/mg,放入培养箱培养8-10 d后固定,Giemsa染色,统计每皿集落数,并计算突变率。同时另做集落形成率测定,每皿接种200个细胞,不加6-TG,每组5个皿。 7d后固定染色,计算集落形成率。
E
D=--- ……………………………(2)
F
    式中: D——集落形成率;
B——实际存活的细胞集落数;
F——接种细胞数。
4.6  计算
H 1
G=---×--- ……………………………(3)
I D
式中:G——突变率;
     H——突变集落数;
     I——接种细胞数;
     D——集落形成率。
5  结果判定
5.1  若阴性对照中,集落形成率低于50%,结果应不予采用。
5.2  各实验室选用的阳性对照突变率有一定范围,若受试物的结果为阴性或弱阳性时,阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上,否则结果不能成立。
5.3  当突变率为自发突变率的3倍或3倍以上,或至少在3个浓度范围内突变率有随浓度递增而升高的剂量反应关系时,可判为阳性。

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附加说明:
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准主要起草人冯继农、高矾。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

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