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哮喘大鼠模型的制作和T淋巴细胞的分离

来源:丁香园论坛 2007-01-15 21:48

大鼠哮喘模型的分组及建立
实验大鼠分组:
根据随机化原则,将24只雄性Wistar大鼠(体重190-250g) 按体重编号,采取随机排列表法分为以下4组:(1)正常对照组、(2)哮喘一周组(激发一周)、(3)哮喘两周组(激发二周)和(4)哮喘四周组(激发四周及以上)。
哮喘模型的建立:
第一天三组哮喘组大鼠每只大腿内侧皮下注射OVA悬液1ml(OVA10mg+氢氧化铝200mg+0.9%生理盐水至1ml),同时腹腔内注射灭活百日咳杆菌悬液1ml (约6*109个菌株)作为佐剂,第8天重复致敏一次,第15天开始将大鼠置于自制玻璃容器中,隔日用402超声雾化器(上海四菱医疗器械厂)给于中等雾量的2%的OVA悬液50ml激发30分钟,每周至少3次,分别按分组激发1周、2周和4周及以上。OVA悬液激发后以大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快、行动迟缓或俯伏不动等症状以及肺内组织病理切片显示嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润,小气道和小血管收缩为哮喘激发成功。
正常对照组腹腔内注射等量PBS1ml代替OVA悬液,2周后雾化吸入中等雾量的PBS液50ml共30min,每天一次,共15天。
T 淋巴细胞的分离及体外培养
对各组大鼠无菌操作行肠系膜下静脉穿刺采血10ml,分装于离心管后用等量PBS液稀释,然后缓慢加于等体积的淋巴细胞分离液上,使形成层次分明的界面。
2200rpm离心20分钟,可见层次分明的界面。吸出离心管中间的一层乳白色的液体,加入0.85%的氯化铵以破碎红细胞并室温静置2分钟,然后用PBS终止反应。 室温1800rpm离心10分钟,去除上清。
继续用PBS稀释液先后洗涤2次,每次1600rpm离心15分钟;
去除上清后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将沉淀调至1ml并轻轻吹打混匀,置37℃,5%CO2 温箱孵育1小时;
将细胞悬液进一步用无菌尼龙棉柱37℃,5%CO2 温箱培养1小时,分离出T细胞,台盼兰染色试验活细胞〉90%;
用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整T细胞浓度为2*106/ml,接种于24孔培养板内,每孔各1ml,于5%CO2、37℃培养箱内培养。
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