研究揭示底物磷酸基团在转酮酶催化中的多重功能

近日，国际知名期刊《ACS Catalysis》在线发表了上海交通大学生命科学技术学院戴少波课题组的研究成果“Multifaceted Role of the Substrate Phosphate Group in Transketolase Catalysis”。生命科学技术学院长聘教轨副教授戴少波，德国哥廷根大学教授Kai Tittmann为论文的共同通讯作者，生命科学技术学院博士后柳志永和博士生肖城良为论文第一作者。生命科学技术学院林双君特聘教授为论文提供了宝贵意见。

磷酸基团是能量分子ATP和代谢途径中间体化合物的通用基团，而大自然为什么选择磷酸基团，一直是学术界关注的焦点问题。转酮酶（TK）是磷酸戊糖途径和卡尔文循环中的关键酶，可逆性催化供体磷酸酮糖到受体磷酸醛糖的2碳单元转移。转酮酶反应机理可概括为：（1）供体底物X5P与辅酶ThDP的共价结合；（2）底物C3-OH的去质子化导致C2-C3键断裂和第一产物释放；（3）烯胺中间体与受体底物R5P反应形成下一个共价中间体S7P-ThDP；（4）S7P-ThDP共价键断裂和产物S7P释放（图1）。

图1. 转酮酶的反应机理

底物的磷酸基团通常不直接参与酶催化，但在底物结合和识别中发挥重要作用。为了理解底物磷酸基团在转酮酶催化中的作用，我们分析了磷酸化底物(X5P和F6P)和去磷酸化底物的晶体结构特征。其中，hTK与木酮糖5-磷酸形成X5P-ThDP共价中间体结构（图2），磷酸基团与周边残基相互作用；去磷酸基团后，该加合物在C2-C3键裂解，形成DHEThDP中间体，DHE部分与活性位点残基如His77、H110、Gly123和Gln428形成氢键（图3）。通过分析捕获的DHEThDP中间体的键长/键角和构型，发现C2-C2α键（1.35Å）明显短于典型的C-C单键（1.51Å），但与典型的C-C双键（1.34Å）非常相似。其次，这种键与噻唑环不在统一平面内，表现出约13°的平面外畸变。前期研究表明，Breslow中间体具有高度反应性，可以很容易地质子化、脱水或氧化。当与天然底物反应时，Breslow中间体不会在TKs中积累，而是作为与酮糖底物的共价偶联物保持在“稳定储存”状态。这可以最大限度地降低副反应，可能是控制碳阴离子/烯胺中间体在酶催化中反应性的一种策略。基于NMR进行了反应中间体分析，发现反应平衡已经从对天然底物观察到的供体-ThDP共价中间体转移到DHEThDP烯胺中间体。

图3. hTK与木酮糖形成DHEThDP中间体结构（PDB: 8WAA）

该研究表明TK供体底物的磷酸部分是转酮酶催化中物理扭曲的共价中间体稳定的关键。底物磷酸基团在TK催化中有两个未被认识的作用——将底物ThDP中间体稳定在高能状态，及在缺乏醛糖受体的情况下防止反应性烯胺中间体的形成，从而保证受体交换的“门控机制”（图4）